从生物能源到能源合成生物学——创新合成生物技术,助力能源安全体系建设

能源是人类社会发展的基础和动力,能源供应关系到国家安全和社会稳定,建立能源安全体系对保证国家繁荣发展、人民生活改善、社会长治久安至关重要。化石能源在过去200年间支撑了人类文明的巨大发展,然而其资源储量有限、不可再生,且利用过程中伴随着大量温室气体排放和其他环境污染,难以满足未来可持续型能源结构体系的建设需求。可再生能源是指自然界中能够循环再生、不随人类利用而减少的能源,具有清洁、低碳的特点,是能源供应技术的重要发展方向。

热纤梭菌在生物质能源开发中的合成生物学研究进展

农林废弃物、能源植物、微藻等生物质是唯一同时具备“能源”和“物质”双重属性的可再生资源,在替代不可再生的化石能源方面具有巨大的潜力。木质纤维素生物转化的核心之一在于高效生物催化剂的构建。热纤梭菌是高效降解木质纤维素的嗜热厌氧菌,是多种木质纤维素生物转化策略的理想底盘菌株,在生物质能源开发中具有重要价值。经过近二十年的研究和开发,针对热纤梭菌已经建立了多种遗传改造技术,并构建了可以生产多种能源分子及化学品的热纤梭菌细胞工厂。本文首先介绍了热纤梭菌及其纤维素降解与利用特性,简述了热纤梭菌的系统生物学研究和遗传改造工具开发的现状,随后重点回顾和总结了热纤梭菌在生产乙醇、丁醇、异丁醇、氢气、乳酸、中/短链脂肪酸酯和可发酵糖等生物能源开发中的合成生物学研究进展。最后对热纤梭菌的合成生物学发展方向进行了展望,并强调了合成生物学技术在未来生物质能源开发中的重要作用。

纤维小体在合成生物学中的应用研究进展

纤维小体是一种高效降解木质纤维素的多酶复合体,主要由自然界中一些梭菌纲厌氧细菌合成及分泌。纤维小体具有模块化、多样化、自组装、协同高效、底物自适应等特征,与合成生物学的工程化策略非常吻合,近年来在生物技术特别是合成生物技术中得到了大量的应用。本文简要介绍了纤维小体的基本架构和高效作用机制,从不同的方面综述了纤维小体在合成生物学研究中的应用研究进展,包括人工纤维小体、底物通道与合成代谢通路构建、细胞表面展示与酶固定化、仿纤维小体设计与构建等。并对纤维小体当前研究的热点问题及其在合成生物学中的应用方向进行了展望,可以预见,基于纤维小体研究所获得的多种蛋白质元件以及建立的工程化策略将在合成生物学中发挥重要作用。

工业丝状真菌土曲霉合成生物技术研究进展及展望

丝状真菌作为一类重要的微生物,在食品、医药、化工等国计民生领域发挥了重要作用,其合成生物技术的发展已经展示了更大的工业应用潜力。土曲霉是一种非常具有工业生产价值的丝状真菌,是生物基化学品衣康酸和降血脂药物洛伐他汀的工业生产菌,展现出了强大的天然产物合成能力和突出的工业发酵性能,具有成为典型性丝状真菌底盘细胞应用于合成生物技术开发的价值。近年来,在土曲霉工业菌株改造与发酵工艺优化、生物合成机制解析等方面都开展了系列的研究,显著推动了其合成生物技术研究的发展。本文综述了土曲霉合成生物技术工具开发、衣康酸和洛伐他汀工业生产菌株改造优化、次级代谢产物生物合成机制解析等方面的最新研究进展,并对土曲霉的合成生物技术应用前景和发展方向进行了展望。挖掘土曲霉底盘细胞在合成生物学研究中的优势,可以更好地拓展合成生物技术的应用。

原位电离质谱技术在微生物菌株筛选中的应用进展

质谱是一种强大的分析工具,可提供分子量和化学结构信息。它具有高特异性、高灵敏度、快速、普适性、微量和非标记等优点。在合成生物学的“设计-构建-测试-学习”工程化策略中,质谱具有重要的应用潜力。随着质谱仪器及其方法体系的不断发展,质谱,特别是原位电离质谱技术,已经成为检测和筛选微生物菌株的重要工具。它能够获取完整的细胞代谢表型,用于合成生物学中的“测试”环节高通量筛选和成像。本文重点介绍了经典的基质辅助激光解吸/电离质谱技术和基于电喷雾、激光和等离子体的原位电离质谱技术的工作机制。此外,还综述了这些质谱技术可以在无需样品预处理的情况下直接检测完整的微生物细胞,以及在微生物突变文库的高通量筛选和活微生物菌落的质谱成像方面的研究进展。最后,总结了原位电离质谱技术在合成生物学中的应用。原位电离质谱技术具有微量、无标记、高通量、普适性、高灵敏度等特点,将在合成生物学“测试”环节的高通量筛选装备中发挥重要作用。

基于紫外诱变与生物合成基因簇倍增的多氧霉素高产菌株构建

多氧霉素是一种抑制几丁质生物合成的广谱抗真菌类抗生素,对多种真菌引起的农作物病害具有显著的防治效果,且对人和动植物无害,是一种绿色安全的生物农药,目前仍然是全球应用最广泛的抗真菌农药之一。多氧霉素的主要作用机制在于竞争性抑制真菌细胞壁合成中几丁质合成酶的活性,因此对农作物真菌病害具有显著的防治效果。现代农业的发展对于绿色生物农药的需求日益增长,本研究的目的是构建多氧霉素关键活性成分——多氧霉素B的高产菌株。从一株自土壤环境中分离得到的金色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)出发,首先通过紫外诱变初步筛选多氧霉素B的高产突变菌株;然后利用ExoCET直接克隆技术对多氧霉素基因簇pol进行克隆,并在基因簇第1个基因上游分别添加原始启动子和kasOp*强启动子,通过整合酶phiC31将基因簇整合到突变株染色体上构建pol倍增菌株,HPLC-MS检测比较多氧霉素B的产量。通过紫外诱变育种和筛选获得了链霉菌突变株Pol-12菌株,其产量较野生型菌株提高了1.2倍。为进一步提高多氧霉素产量,利用ExoCET直接克隆技术将pol克隆至p15A载体,并通过接合转移转化Pol-12菌株获得pol倍增菌株S.ansochromogenes Pol-12::Pori-pol(M1)和S.ansochromogenes Pol-12::PkasOp*-pol(M2)。与受体菌Pol-12相比,菌株M1和M2多氧霉素B的产量分别提高了22倍和33倍。因此得出结论:紫外随机诱变育种联合基因工程定向育种可有效应用于多氧霉素高产菌株的构建,增加基因簇的拷贝数以及强启动子插入有效提高了多氧霉素B的产量。

嗜热蓝细菌高温适应机制及生物技术应用

嗜热蓝细菌是一类具有独特耐热特征的蓝细菌,可以作为研究光合生物高温适应机制的模式生物。系统解析嗜热蓝细菌的高温适应机制,有助于深入理解光合生物及其他微生物响应和适应高温环境的分子机理,同时还具有指导耐热作物培育和构建微生物耐热细胞工厂的潜在应用前景。本文全面综述了嗜热蓝细菌的相关研究进展,包括其生态分布、形态特征、组学研究和耐热机制挖掘等多个方面;此外,还对嗜热蓝细菌在生物技术领域的应用前景与未来研究方向进行了展望。本文为深入了解蓝细菌光合生理与代谢特点,特别是嗜热蓝细菌在高温适应机制方面的研究提供了参考。

细菌中Ⅰ型毒素-抗毒素系统的研究进展

毒素-抗毒素系统是广泛存在于细菌和真菌细胞内的一对小型遗传控制元件,毒素基因编码稳定的蛋白质分子,抗毒素基因编码的则是稳定性较差的蛋白质或者是具有调控功能的RNA.人们对于毒素分子在细胞内的生物靶标、分子结构与功能、体内调节机制等进行了大量的研究,不仅揭示了毒素-抗毒素的生理功能,而且为多种生物技术中的应用提供了新的素材.目前发现共有5大类型的毒素-抗毒素系统,其中Ⅰ型毒素-抗毒素系统的抗毒素分子为调节型RNA,可以通过多种不同途径与毒素蛋白质的mRNAs结合从而中和毒素的细胞毒性.Ⅰ型毒素-抗毒素系统以其独特的调节性RNA的调控方式,成为目前毒素-抗毒素研究中的重要热点.本文将对目前Ⅰ型毒素-抗毒素系统的研究进展进行综述,并对其可能的应用前景进行展望.

短密青霉NRRL 864异戊烯基转移酶PbPT的克隆表达及功能分析

在对丝状真菌短密青霉(penicillium brevicompactum NRRL 864)的全基因组进行分析时,发现该真菌可能表达一种异戊烯基转移酶PbPT。通过反转录RT-PCR(Reverse Transcription,RT-PCR)获得真菌cDNA,并以cDNA为模版,将编码PbPT的开放阅读框克隆到pET-28b构建表达载体pET28b-PbPT,将pET28b-PbPT转化Escherichia coli BL21(DE3)获得表达菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导高效表达PbPT,利用Ni-NTA树脂亲和纯化重组PbPT活性蛋白,并对该蛋白进行了底物特异性分析、产物结构鉴定以及酶促动力学分析。分析结果表明,以二甲基丙烯基二磷酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP)为供体,PbPT特异性催化异戊烯基转移至Brevianamide F的α位C上,生成Deoxybrevianamide E。Brevianamide F是合成真菌生物碱类杀虫抗生素brevianamides的重要中间体,真菌吲哚类异戊烯基转移酶家族新成员PbPT的发现。该研究为进一步寻找和阐明真菌生物碱类杀虫抗生素brevianamides的生物合成基因簇和合成途径奠定了基础。

碳离子束诱变选育高产角鲨烯类酵母及电转化初探

为进一步提高角鲨烯产量,以海洋产角鲨烯类酵母(Pseudozyma sp.)SD301为出发菌株,采用碳离子(;C;)束诱变技术选育高产角鲨烯的突变菌株,并对突变菌株的电转化条件进行优化。利用100μmol·L^(-1)过氧化氢(H;O;)作为筛选压力,在12C6+束辐照剂量为120 Gy时,获得了比出发菌株具有更高角鲨烯产量的突变株PS120,该突变株在培养3 d后,角鲨烯产量达到1.33 g·L^(-1),角鲨烯质量(细胞质量)达到41.31 mg·g^(-1)。利用绿色荧光蛋白EGFP作为表征标记,对PS120进行电转化条件优化,酶切、电泳和测序研究结果表明900 V电压条件下可成功将编码EGFP的基因转入到PS120细胞中,通过激光共聚焦显微镜进一步证实EGFP蛋白在该细胞中高水平表达。

大学物理化学课程教学改革的思考与实践

物理化学是一门通过使用物理学原理与方法研究化学现象和化学反应过程的一门学科,具有学科交叉、应用性强的特点,教师教学难度和学生学习难度可想而知,教与学现状都有待改进.本文从教学实践出发,以培养学生观察、理解、学习、沟通、实践动手能力及创新意识为主线和着力点,提出以学生为中心进行物理化学课程教学改革的措施.

洛伐他汀工业菌株土曲霉HZ01的次级代谢产物合成分析

【目的】分析洛伐他汀工业生产菌株土曲霉HZ01的次级代谢产物合成能力,为后期的遗传改造、次级代谢产物及其基因簇挖掘提供指导。【方法】对洛伐他汀发酵条件下的样品进行了转录组分析,同时运用色谱分离技术及波谱学方法对主要次级代谢产物进行了分离和结构鉴定。【结果】洛伐他汀合成相关基因转录水平非常高,还有4个聚酮合酶(PKS)、6个非核糖体多肽合成酶(NRPS)和1个PKS-NRPS杂合酶基因进行了转录,其他PKS和NRPS基因都处于沉默状态。此外,从该菌的发酵产物中分离鉴定了10个主要副产物并确定了其结构。【结论】土曲霉HZ01是一株优良的洛伐他汀生产菌株,在构建次级代谢产物异源合成细胞工厂和鉴定次级代谢产物生物合成途径方面具有很好的应用潜力。

细胞色素P450酶催化的烷烃选择性羟化

碳氢键选择氧化是合成化学领域的重要课题,其中烷烃选择性羟化反应更是面临着化学选择性、区域选择性和立体选择性等多重挑战.细胞色素P450酶广泛分布于动植物和微生物体内,是公认的多功能生物氧化催化剂.P450酶对惰性C—H键的选择性氧化具有独特优势,在催化烷烃选择性羟化反应方面拥有巨大潜力.本综述简述了P450单加氧酶及其催化烷烃选择性羟化的反应机理,梳理了来自CYP153家族、CYP52家族和其他家族的天然P450酶催化各类烷烃底物的氧化反应和选择性,讨论了理性设计和定向进化策略在开发烷烃羟化P450突变酶过程中的经典案例,介绍了底物工程、诱饵分子、双功能小分子协同催化等几种化学活化P450酶的策略及其在烷烃羟化上的应用,探讨了P450酶在烷烃选择性羟化方面所面临的挑战和解决途径,并展望了其应用前景.

嗜热厌氧菌Caldicellulosiruptor sp. F32中降解β-1,3-1,4葡聚糖水解酶的协同性分析及糖基化对F32EG5热稳定性影响

【目的】通过研究来自极端嗜热厌氧菌Caldicellulosiruptor sp.F32中3个可降解β-1,3-1,4葡聚糖(β-葡聚糖)的糖苷水解酶,解析其在降解β-葡聚糖过程中协同作用,以及异源表达的糖基化修饰对β-葡聚糖酶F32EG5热稳定性的影响,为该系列水解酶的应用提供考据。【方法】通过大肠杆菌异源表达β-葡聚糖酶F32EG5和Lam16A-GH,以及β-葡萄糖苷酶BlgA,利用DNS、TLC等方法检测其在β-葡聚糖降解过程中的协同性及底物耐受能力。随后,利用毕赤酵母对F32EG5进行异源表达,以及对糖基化修饰的p-F32EG5进行酶学对比。【结果】β-葡聚糖酶F32EG5和Lam16A-GH单独作用于底物时,水解产物不同。但混合使用时,低聚合度寡糖的比例增加。β-葡萄糖苷酶BlgA分别与F32EG5和Lam16A-GH复配时,均展示出良好的协同效应和底物耐受能力。此外,利用毕赤酵母异源表达的p-F32EG5,没有明显改变其最适pH和最适温度,但在超高温下(80–90°C)的热稳定性和催化效率相对于未被糖基化的F32EG5提高2倍以上。【结论】葡萄糖糖苷水解酶BlgA分别与β-葡聚糖酶F32EG5、Lam16A-GH复配,在水解β-葡聚糖过程中表现出良好的协同性和底物耐受能力,同时毕赤酵母异源表达的糖基化修饰能提高在超高温环境下的热稳定性能,有利于酶制剂生产造粒过程中的酶活保留,从而使F32EG5具备应用化潜力。