疫苗免疫压力下新城疫病毒的动态演化

国内大量新城疫病毒(NDV)血凝素基因F和HN的测序表明,NDV主要免疫原HN和F基因与生产中广泛应用的经典疫苗La Sota株的核苷酸同源性不足80%,而NDV流行株之间则高达94.4%～100%,从分子遗传学角度证实了VIId型NDV是导致新城疫免疫失败的重要原因。HI交叉抑制和鸡胚中和试验等则从抗原性的角度证实了NDV在免疫压力下抗原性的变化,尽管NDV不同毒株间抗原性变异的程度已出现明显差异,但仍局限在同一个血清型中。

近几年山东省鸡传染性喉气管炎的流行情况及诊治体会

鸡传染性喉气管炎,是由传染性喉气管炎病毒(疱疹病毒科α病毒亚科)引起的一种呼吸道传染病。在自然条件下,本病主要侵害于鸡,虽然各种年龄的鸡均可感染,但以成年鸡的症状最为特征。一年四季都能发生,但以冬、春季节多见。鸡群拥挤、通风不良等,均可促进本病的发生及流行。病鸡及康复后的带毒鸡是主要传染源,污染的垫草饲料、饮水和用具都可成为传播媒介,通过空气及接触传播,经上呼吸道及眼内感染。在同群鸡内部传播速度快,但是在不同鸡群间不容易传播,因此常呈地方流行性。康复鸡可以长期排毒,从而造成本病在某一地区或鸡场长期流行。

山东省血清4型禽腺病毒的分离鉴定

近期从山东省许多地区爆发的以心包积液为主要病变特征的发病鸡中分离到10株病毒,经PCR检测和血清型鉴定,确定为血清4型禽腺病毒。SPF鸡回归试验证实,分离到的病毒能完全复制出与临床自然发病鸡相同的症状与病变。用该病毒制备的灭活疫苗具有良好的免疫保护作用,制作的抗体也具有良好的治疗效果。

日粮中添加桑叶多糖对雏鸡免疫功能的影响

为了探明桑叶多糖对雏鸡免疫功能的影响,本研究采用超声波辅助水提法,辅以离子交换柱层析对其纯化,得到两种不同分子量的桑叶多糖组分(MLP-I、MLP-II)。将两种多糖分别以0.5%的剂量添加到雏鸡的基础日粮中。结果表明,桑叶多糖可以显著提高雏鸡免疫器官指数,能够显著促进细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌,MLP-II的免疫增强效果优于MLP-I。本研究为桑叶多糖的开发利用提供了技术支撑和理论依据。

山东地区新型鸭呼肠孤病毒致病特点与变异分析

本研究将2011~2018年从山东地区分离到的8株新型鸭呼肠孤病毒进行了毒力和致病性试验,结果显示,8株毒株对鸭胚、鸭胚成纤维细胞、雏鸭的致病性基本一致,鸭胚毒价为10-5.00~10-6.00/0.1 m L,鸭胚成纤维细胞的毒价为10-5.33~10-6.30/0.1 m L;对8株毒株的主要抗原σC蛋白核苷酸和氨基酸序列进行比对分析,结果显示,核苷酸同源性为94.5%~99.6%,氨基酸同源性为95.0%~99.4%;通过绘制遗传进化树发现,与全国其他地区毒株相比,山东地区分离的这8株分离株处于一个独立分支,并且这8株分离株的遗传进化与时间有着密切的相关性,暗示山东地区新型鸭呼肠孤病毒随着时间的推移在不断发生着变异。

LAMP技术在家禽腹泻性疾病检测中的应用

快速检测致病微生物是控制疾病暴发的有效方法之一。目前,测病原体的传统方法耗时且劳动强度大,并且通常很容易失去最佳控制疾病的机会。因此,迫切需要一种快速检测疾病的方法。环介导等温扩增(LAMP)是近年来新建立的核酸恒温快速扩增技术。它具有高灵敏度,特异性,视觉检测和对仪器的低需求。它具有节省时间和精力等诸多优点,在分子诊断领域具有很大的潜力。目前,LAMP已被广泛用于检测各种动物病原微生物。本文主要综述了LAMP技术在家禽腹泻病原微生物检测中的应用以及LAMP技术的改进和优化,为快速检测家禽肠道疾病提供了参考。

两株坦布苏病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

2019年,从山东某地疑似坦布苏病毒(TMUV)感染的发病鸭和发病鹅组织病料中进行病毒分离,并通过RT-PCR、间接免疫荧光试验以及基因序列分析,确定分离到1株鸭源和1株鹅源TMUV,并命名为BZ0162和WS12101。将分离株全基因组进行PCR分段扩增、测序,发现BZ0162和WS12101基因组全长包含10 991个核苷酸。全基因组核苷酸同源性比较结果显示,BZ0162和WS12101之间同源性是99.5%,与其他TMUV参考毒株同源性均大于95.7%。E蛋白核苷酸和氨基酸同源性分别大于95.2%和98.0%。遗传进化分析结果显示,BZ0162和WS12101与GenBank最新公布的CHN-JL中国株以及泰国株DK/TH/CU-1亲缘关系最近,处于同一进化分支上。分别成功分离到1株鸭源和1株鹅源坦布苏病毒,为进一步探究坦布苏病毒遗传变异及跨宿主传播机制提供了材料。

一例鸭腺病毒与鸭疫里默氏杆菌混感的诊疗分析

禽腺病毒(FADV)病在世界范围内广泛流行,已成为家禽一种常见的传染病,临床上常见的水禽病还有鸭安卡拉病、鸭包涵体肝炎等类型。2014年广东省暴发了以肝脏苍白为特征的番鸭“白肝病”,2017年江苏、山东、河北等地暴发了水禽腺病毒血清4型,引起鸭安卡拉病,即肝炎-心包积水综合征。腺病毒分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群。

鹅源番鸭呼肠孤病毒的分离鉴定

近几年,鹅“白点病”频发。本研究从江苏沛县地区肝脏有坏死点的发病鹅中收集肝脏病料,进行病毒分离,通过RT-PCR检测、序列分析进行病毒鉴定,并回归雏鹅进行致病性试验。结果发现:该毒株在鹅胚上生长良好;回归鹅能完全复制出临床中肝脏出现坏死点的病变,并能从实验鹅中重新分离到该病毒;对其主要抗原基因σC进行测序比对和进化树分析发现,其与番鸭呼肠孤病毒基因序列的进化关系较近,同源性为89.6~98.9%。本研究证实了鹅“白点病”的病原为番鸭呼肠孤病毒,为该病的防控奠定了基础。

饮水型精油复合酸化剂对蛋鸡生产性能、蛋品质及抑菌效果的影响

试验旨在研究饮水型精油复合酸化剂对蛋鸡生产性能、蛋品质及抑菌效果的影响。选取350日龄罗曼灰商品蛋鸡672只,随机分为4组,每组8个重复,每个重复21只鸡。各组蛋鸡饲喂基础日粮,试验组在饮水中分别添加0.05%、0.10%和0.20%精油复合酸化剂。预试期7 d,正式试验期49 d。结果显示,与对照组相比,添加0.10%、0.20%精油复合酸化剂的蛋鸡产蛋率显著提高(P<0.05)。与对照组相比,试验第21 d,0.05%精油复合酸化剂组蛋壳厚度显著提高(P<0.05);试验第35 d,0.20%精油复合酸化剂组鸡蛋的哈夫单位均显著提高(P<0.05)。不同浓度精油复合酸化剂均能够明显降低饮水pH值,抑制大肠杆菌和沙门氏菌生长。添加0.10%精油复合酸化剂可增加经济效益。研究表明,饮水中添加0.10%的精油复合酸化剂可在不降低蛋品质的基础上提高蛋鸡产蛋率,增加经济效益。

猪流行性腹泻病毒变异株分离鉴定及攻毒模型建立

猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种急性高度接触性肠道传染病。研究成功分离到一株PEDV,命名为PEDV-20200946。对该毒株的S基因进行测序分析,遗传进化树结果显示,该分离毒株属于G2亚群。通过Reed-Muench法测定该毒株毒价为106.1 TCID 50/mL。通过动物回归试验进一步探究该分离毒株对仔猪的致病情况,将12头20日龄仔猪平均分为3组,分别为口服攻毒组、口服+肌注攻毒组和对照组。攻毒后观察临床症状,72 h后采集各组的粪便及发病猪的肠道进行RT-PCR检测和免疫组化分析。结果显示,口服+肌注组仔猪发病最快,口服攻毒组次之,对照未发病。剖检攻毒组仔猪可见其肠壁变薄、肠道膨胀,内含大量黄色液体。免疫组化试验显示,攻毒组猪小肠内可检测到大量PEDV阳性信号,而对照组未检测到。研究建立了PEDV-20200946毒株仔猪攻毒模型,为深入研究PEDV流行毒株的分子特性以及弱毒疫苗的开发奠定基础。

1株鸭坦布苏病毒人工感染雏鸭的病理学研究

7日龄雏鸭经肌肉接种坦布苏病毒BZ株1周后,发病率100%,死亡率为80%。接种鸭全身多数器官出现充血、出血、坏死等症状,病理学变化主要表现在肝实质严重变性、坏死;脾淋巴细胞局部减少;肾小管上皮细胞肿胀;肺淤血,内有大量细胞渗出;胰腺中可见凝固性坏死灶;大脑软脑膜充血、水肿,小脑脑膜上炎性细胞浸润。鸭接种该病毒后,攻毒组的丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、谷氨酰胺转移酶、乳酸脱氢酶水平和血清尿酸的浓度较对照组明显升高。结果表明:坦布苏病毒BZ株可造成全身多器官的病理性损伤以及主要血液生化指标的显著变化,这可能是该病毒致病性的重要机制之一。

新型鸭呼肠孤病毒RT-LAMP检测方法的建立

建立适于基层实验室快速检测新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)的一步反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)方法。基于新型鸭呼肠孤病毒S3基因的6个保守区域设计了4条LAMP引物,利用Bst DNA聚合酶在63℃恒温保持45 min即可完成反转录和扩增反应,由此建立了RT-LAMP检测方法。该方法具有良好的特异性,除NDRV外对其他6种常见鸭病的检测结果均为阴性。该方法对病毒RNA的最低检出量为0.1 pg,是常规RT-PCR方法的100倍。临床应用结果表明,该方法与病毒分离鉴定方法的符合率为98%,而且对仪器的要求低,适于基层实验室和现场检测。

一株韩国新型DHV的分离及RT-PCR鉴定

从山东省某疑似鸭肝炎发病区分离到1株病毒JFX08,血清中和试验结果表明该分离毒与传统的Ⅰ型鸭肝炎病毒无交叉保护,分离毒回归3日龄雏鸭,可复制出鸭肝炎的典型症状和病理变化。根据已公布的韩国新型（基因C型）DHV的序列设计合成一对引物,进行RT-PCR扩增,得到大小约414 bp的目的条带;测序分析发现,分离毒与传统Ⅰ型DHV之间的相似性较低,而与韩国新型DHV之间的相似性高达93.2%~94.0%;进化分析结果表明,该分离毒与韩国新型DHV的遗传距离最近,属基因C型DHV。

用荧光定量RT-PCR方法检测新型鸭呼肠孤病毒

根据新型鸭呼肠孤病毒（novel duck reovirus,NDRV）S1基因序列设计1对特异性引物,建立了基于SYBR GreenⅠ的实时荧光定量RT-PCR检测方法。根据含目的基因的质粒拷贝数与定量反应Ct值的关系,绘制了标准曲线。敏感性试验显示,该方法最低可检出15个拷贝的病毒c DNA,其病毒最低检出量为0.5TCID50。该方法具有良好的特异性,对鸭坦布苏病毒（DTMUV）、A型鸭甲肝病毒（DHV-1）、C型鸭甲肝病毒（DHV-3）、番鸭呼肠孤病毒（MDRV）、减蛋综合征病毒（EDSV）、鸭新城疫病毒（NDV）、鸭瘟病毒（DPV）、鸭疫里默氏杆菌（RA）的检测结果均为阴性。该方法重复性好,组内变异系数为0.32%~0.91%,组间变异系数为1.03%~1.51%。利用该方法对人工感染雏鸭的粪便排毒情况进行检测,结果发现,攻毒后2~12 d是粪便排毒期,其中3~6 d是排毒高峰期。临床样品检测结果表明,该方法比常规RT-PCR具有更高的敏感性,而且从收到样品到得出检测结果只需4 h。

鸭坦布苏病毒鸡胚弱化毒株的选育

【目的】将鸭坦布苏病毒BZ_2010株在SPF鸡胚上进行连续传代致弱;旨在选育安全性高、免疫原性好的活疫苗候选毒株。【方法】以SPF鸡胚为增殖宿主,将BZ_2010株连续传代,直至第120代;以1日龄雏鸭和30周龄的产蛋种鸭为试验对象,对第120代次毒株(命名为VC2)的安全性进行评价;以1d雏鸭为试验对象,对VC2株的返强情况进行评价;以18周龄的种鸭为试验对象,对VC2株免疫后的中和抗体进行监测;以25周龄的种鸭为试验对象,对VC2株免疫后的保护效果进行评价;利用RT-PCR方法分别扩增BZ_2010株和VC2株的E基因和N54A基因,进行测序分析。【结果】传代病毒对鸡胚的平均死亡时间逐渐缩短,而病毒毒价有逐)渐提高的趋势,ELD_(50)由第20代的10^(-5.3)/0.1 mL提高到第120代的10^(-5.8)/0.1mL,而且第80代之前提高较快,后期基本稳定。将VC2株通过颈部皮下接种1d雏鸭和肌肉接种30周龄产蛋种鸭,接种后试验鸭无异常临床表现,肝脏也无明显病理变化,这说明VC2株具有良好的安全性。将VC2在1d雏鸭进行连续5次传代,未发现试验鸭有任何异常症状,将第5代组织悬液接种1d雏鸭,采集肝脏进行病理切片观察,发现无明显病理变化,这说明VC2株具有良好的稳定性。基因测序分析结果显示,VC2株E蛋白的第86、157、189、301和312位氨基酸发生改变,而NS4A蛋白只有一个氨基酸发生突变,即第54位氨基酸由F变为L。VC2免疫种鸭后抗体水平上升很快,第4周即可达到高峰,并且维持较长时间;VC2免疫后于第2周和第50周利用强毒株进行攻毒试验,结果VC2免疫组在攻毒后未出现异常症状,粪便正常,产蛋率保持正常,这说明VC2株免疫可对强毒株的攻击产生完全保护。【结论】通过鸡胚连续传代成功获得了一株安全性高、免疫原性好的鸭坦布苏病毒鸡胚弱化毒株。VC2免疫种鸭后抗体水平上升很快,可维持较长时间。攻毒试验结果表明,VC2株免疫可对强毒株的攻击产生完全保护。

一株肉鸡呼肠孤病毒变异株的分离鉴定

旨在研究肉鸡呼肠孤病毒分离株致病与基因组变异情况。2017年从山东潍坊地区跗关节肿胀、出血严重商品肉鸡中收集病料,进行病毒分离,通过RT-PCR检测、电镜观察对病毒进行鉴定;将分离到的病毒回归商品肉鸡;设计18对引物对分离株全基因组扩增测序,并进行了遗传进化分析;将分离毒株与经典毒株S1133进行血清交叉中和试验。结果表明分离到一株禽呼肠孤病毒(命名为WF17),回归商品肉鸡能完全复制出临床症状,并能从试验鸡中重新分离到该病毒。该分离株基因组完全符合禽呼肠孤病毒基因组结构特点,主要抗原σC蛋白基因与台湾918株最接近,相似性为92.7%,与S1133株的相似性只有55.9%。WF17株与S1133株的抗原相关指数(R值)只有0.19。目前以S1133株为主的商品化疫苗无法对禽呼肠孤病毒变异株产生有效保护。

自然发生的1株传染性支气管炎病毒S1和N基因之间的重组

本研究从出现典型呼吸道和肾脏病变的患病雏鸡中分离出1株传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitisvirus,IBV),命名为SC06,旨在探讨该病毒的重组机制。SC06接种10日龄SPF鸡胚可出现明显的"侏儒胚";对5日龄SPF鸡攻毒,可诱发呼吸道症状和肾脏病变。对其S1和N基因分别克隆测序,结合在GenBank中发表的其他IBV参考株序列,对其S1和N基因核苷酸(氨基酸)序列分别进行同源比较,绘制系统发育树。结果表明:SC06与英国4/91株的S1基因核苷酸(氨基酸)同源性最高,为98.7%(98%),而与国内大部分流行株的核苷酸同源性仅为75.6%～76.0%;然而,SC06与国内流行株DY06、SDGE01的N基因核苷酸(氨基酸)同源性达99.3%(99%)、93.4%(93.6%),而与英国的4/91的N基因核苷酸(氨基酸)同源性仅为85.7%(92.4%)。S1基因系统发育方面,SC06与英国的4/91和7/93B属于同一基因型,而与作者实验室近年分离的SDGE01等大部分山东流行株及国内流行的LX4等株分属不同的基因型;但其N基因分型时,SC06和DY06与国内部分流行株属于同一个进化分支,而与英国的4/91和7/93B不同。综合上述结果,推测SC06为英国4/91和国内流行株的重组株,其S1基因来自4/91疫苗,而N基因来自国内DY06类型的IBV国内流行株。

正常蛋与暗斑蛋的品质和蛋壳超微结构差异分析

本研究旨在探明正常蛋与暗斑蛋的蛋品质和蛋壳超微结构方面的差异。以寿光鸡为研究对象,收集正常蛋和暗斑蛋各60枚,统计蛋品质和蛋壳超微结构等数据。研究结果显示,暗斑蛋的哈氏单位、蛋白高度极显著低于正常蛋(P<0.01),蛋重显著高于正常蛋(P<0.05),蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋壳比率高于正常蛋,但差异不显著(P>0.05),蛋形指数、蛋黄比率和蛋黄颜色和正常蛋几乎没有差异;暗斑蛋的乳突层厚度、有效层厚度显著高于正常蛋(P<0.05)。结果表明暗斑蛋与正常蛋在蛋品质和蛋壳超微结构方面存在差异。

基因C型鸭肝炎病毒VP1基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备

采用RT-PCR方法,扩增基因C型DHV JFX08株的VP1基因,与pMD18-T载体进行连接,构建新型DHVVP1基因克隆重组质粒。然后将VP1基因定向插入到pET-32a(+)表达载体中,筛选原核表达载体pET-32a-VP1,进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析表明,基因C型DHV-VP1基因可在大肠杆菌中稳定高效的表达。Western-blot检测表明,表达产物可与基因C型DHV阳性血清发生特异性反应。将纯化的重组蛋白免疫4周龄SPF鸡,以纯化的VP1重组蛋白和基因C型DHV全病毒分别包板,制备的抗血清ELISA效价分别可达1∶25 600,1∶51 200,表明该重组蛋白具有良好的免疫原性。