截断型线粒体凋亡诱导因子相互作用蛋白质的筛选与鉴定

线粒体凋亡诱导因子(AIF)是一类存在于线粒体内外膜之间保守的黄素蛋白,它从线粒体到细胞核的转位可诱导细胞凋亡.AIF诱导细胞凋亡的确切机制还不是很清楚.为了筛选可能与截断型AIF存在相互作用的蛋白质,探讨截断型AIF诱导细胞凋亡的机制,用逆转录PCR扩增剪切掉线粒体定位信号的人AIF基因片段并克隆入pcDNA3.1载体,导入肝癌HepG2细胞.成功检测到截断型在转录与翻译水平上的表达.提取转染截断型AIF基因的细胞的蛋白质,用免疫沉淀方法分离与截断型可能存在相互作用的蛋白质,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对分离得到的蛋白质进行鉴定,其中一蛋白质条带经鉴定为β-actin.再次用反向免疫共沉淀法与Western blot法对筛选出的可能相互作用蛋白质进行验证.结果表明,截断型AIF与β-actin之间可能存在相互作用.

人颗粒溶素对肝癌细胞SMMC-7721凋亡、线粒体跨膜电位及细胞色素C释放的影响

目的构建携带人颗粒溶素（GLS）的真核表达质粒pBudCE4．1／GLS并研究其表达后对肝癌细胞SMMC-7721凋亡，线粒体跨膜电位与细胞色素C转位的影响。方法将RT—PCR扩增出的人GLS编码基因克隆入pBudCE4．1载体中构建真核表达质粒pBudCE4．1／GLS并将其转染肝癌细胞株SMMC一7721，用RTPCR、免疫细胞化学检测GLS的表达；用Hoechst法及电镜检测细胞的凋亡状况；用荧光染料Mitocapture^TM检测线粒体跨膜电位、用Western blot法检测细胞色素C从线粒体的释放。结果成功构建了携带GLS的真核表达质粒pBudCE4．1／GLS；在转染的肝癌细胞株SMMC-7721中，从转录和翻译水平都检测到了目标基因GLS的表达产物；重组质粒转染SMMC-7721细胞后，细胞核染色质固缩，呈致密浓染的凋亡状态，线粒体膜跨电位下降并伴随有细胞色素C从线粒体至细胞质的释放。结论携带人GLS的真核表达质粒在肝癌细胞SMMC-7721中表达后有致细胞凋亡作用，引起线粒体跨膜电位下降与细胞色素C的释放可能是其诱导肿瘤细胞凋亡的途径之一。