1997至2002年山东省眼科研究所穿透性角膜移植术的原因分析

目的探讨1997至2002年山东省眼科研究所6年间行穿透性角膜移植术(PKP)的原因及其变化。方法对1997年1月至2002年12月山东省眼科研究所的所有PKP病例进行回顾性调查,将PKP的原因分为10类:化脓性角膜炎、单纯疱疹病毒性角膜炎、圆锥角膜、大泡性角膜病变、角膜白斑、角膜破裂伤、角膜烧伤、再次PKP、遗传相关的角膜营养不良和角膜变性及其他。并且记录化脓性角膜炎的病原菌,大泡性角膜病变的病因,再次PKP的原发病和再次手术的原因。分析6年间PKP的原因及其变化情况。结果共调查1702例PKP患者。PKP的原因依次是化脓性角膜炎542例(31．9％)、单纯疱疹病毒性角膜炎299例(17．6％)、圆锥角膜219例(12．9％)、角膜白斑164例(9.6％)、大泡性角膜病变118例(6．9％)、角膜破裂伤105例(6．2％)、再次PKP 77例(4．5％)、角膜烧伤70例(4．1％)、遗传相关的角膜营养不良和角膜变性67例(3．9％)及其他41例(2．4％)。圆锥角膜(X2=26．399,P<0．001)和大泡性角膜病变(X2=11．4229,P<0．001)所占比例呈明显上升趋势,其他原因则无明显变化。化脓性角膜炎中真菌感染居首位(65．9％),6年来各病原菌所占比例无明显变化。多数大泡性角膜病变患者有内眼手术史,其中白内障手术最常见(76．3％)。再次PKP的原发病以角膜烧伤(24．7％)、单纯疱疹病毒性角膜炎(23．4％)及化脓性角膜炎(14．3％)为主,再次手术的原因主要是免疫排斥(61．0％)、植片感染(14．3％)及单纯疱疹病毒性角膜炎复发(10．4％)。结论感染性角膜病仍然是PKP的主要适应证,其中真菌感染为首位病因。圆锥角膜和大泡性角膜病变均呈明显上升趋势。

免疫刺激剂CpGODN防治烟曲霉菌引起的变态反应性结膜炎的实验研究

背景研究证实免疫调节剂CpGODN对蛋白类过敏原引起的变态反应性结膜炎有防治作用，但其对真菌引发的变态反应性结膜炎是否有类似作用尚不清楚。目的研究局部应用CpGODN是否能够预防或减轻烟曲霉菌引发的变态反应性结膜炎。方法建立烟曲霉菌变态反应性结膜炎小鼠模型，用CpGODN或对照ODN（GpCODN）对其进行干预，PBS干预作为阴性对照。实验分为预防实验（模型动物在变态反应原再次激发前给药）和治疗实验（激发后给药），对小鼠眼部临床症状进行评分。取小鼠结膜组织进行组织病理学检查，并计数标本中的炎性细胞。应用实时定量聚合酶链反应（real-timePCR）法动态观察小鼠结膜组织中TLR4mRNA的变化；将烟曲霉菌免疫原与眼部回流淋巴结和脾脏的细胞进行共培养，流式细胞分析培养细胞中调节性T淋巴细胞的比例和活化状态。结果预防实验中，结膜下注射CpGODN组与GpCODN对照组、PBS对照组比较，小鼠眼部过敏症状评分差异均无统计学意义（P〉0．05）；CpGODN组与GpCODN对照组、PBS对照组比较结膜组织中性粒细胞数降低，差异均有统计学意义（21．25±11．59vs30．75-4-_11．44，21．25±11．59vs69．00±9．90；t=5．140，t=3．210，P〈0．01）；TLR4mRNA表达上调。在治疗实验中，CpGODN组与GpCODN对照组、模型对照组比较，跟部过敏症状评分降低（t=4．000，t=2．750，P〈O．05）；中性粒细胞数显著减少（t=4．870，t=3．829，P〈0．01）。CpGODN治疗组小鼠眼部回流淋巴结CD4^＋CD25^＋细胞以及CD4^＋CD25^＋CD69’细胞所占的比例均显著高于GpCODN组和PBS对照组（P〈0．05）。结论CpGODN通过上调结膜TLR4的表达、活化Treg细胞来预防和治疗烟曲霉菌引起的变态反应性结膜炎，预先结膜下注射和点眼均可减轻小鼠眼部过敏症状和晚期结膜炎性细胞的聚集。

左氧氟沙星白芨多糖滴眼液的眼部药物代谢动力学研究

目的评价5g.L-1左氧氟沙星白芨多糖滴眼液(左氧白芨滴眼液)滴兔眼后,药物在眼部的药物代谢动力学,以及与5g.L-1左氧氟沙星滴眼液(可乐必妥)比较其相对生物利用度。方法新西兰大白兔64只(128眼),平均分为2组,实验组给予左氧白芨滴眼液50μL滴眼,对照组给予可乐必妥50μL滴眼。分别于不同时间点取房水和角膜,应用高效液相色谱法测定左氧氟沙星浓度。采用DASver2.0药物代谢动力学程序计算各药物代谢动力学参数。结果所建立的高效液相色谱法能将左氧氟沙星与其他杂质很好地分离,其最低定量浓度为53.95μg.L-1,组织中回收率稳定。左氧白芨滴眼液与可乐必妥在房水中的半衰期(t1/2)分别为90.512min和106.480min,达峰时间(tmax)分别为45.000min和60.000min,达峰浓度(Cmax)分别为2318.973μg.L-1和1111.457μg.L-1(P<0.05);角膜中t1/2分别为109.400min和64.956min,tmax分别为10.000min和15.000min,Cmax分别为23.012μg.g-1和16.389μg.g-1。左氧白芨滴眼液组房水和角膜中药物质量浓度曲线下面积(AUC0-240)分别是可乐必妥组的1.79倍和1.37倍。结论左氧白芨滴眼液较可乐必妥生物利用度显著提高。

眼部疾病中上皮细胞转型相关信号通路的研究进展

上皮细胞间质转型(EMT)是一种基本的病理生理现象,参与胚胎发育、组织重构和肿瘤转移等过程,以上皮细胞表型的缺失及间质特性的获得为重要特征,主要表现为具有极性的上皮细胞转化成具有活动能力、能够在细胞基质间自由移动的间质细胞。研究发现,各种刺激通过多种不同的信号途径诱导上皮细胞发生EMT是许多眼部疾病,如视网膜母细胞瘤、创伤后白内障、视网膜新生血管形成等重要的病理变化过程。就眼部疾病中与EMT有关的信号通路进行综述。

ATP生物荧光检测仪在眼科精密器械清洗质量控制中的应用效果

目的探讨ATP生物荧光检测仪在眼科精密器械清洗质量控制中的应用效果。方法医院于2019年1月开始对眼科精密器械开展全面清洗管理,将ATP生物荧光检测仪应用在器械清洗中,开展清洗质量控制工作,以最大程度提高眼科精密器械清洗质量,减少院内感染风险。对管理前后器械清洗质量进行对比。结果将ATP生物荧光检测仪应用到眼科精密器械清洗工作中后,有齿类、无齿类、管腔类器械的清洗合格率均明显提高,与全面管理前相比差异显著(P<0.05);ATP监测表面采样、水质采样检测结果显示,器械外表和管腔内细菌检测数量相当,差异无统计学意义(P>0.05)。结论将ATP生物荧光检测仪应用到眼科精密器械清洗中,可显著提高器械清洗效果,在清洗质量控制中发挥重要作用。

三种常用非甾体类抗炎滴眼液对人角膜上皮细胞的毒性研究

背景 双氯芬酸钠滴眼液、普拉洛芬滴眼液和溴芬酸钠滴眼液是眼科临床常用的非甾体类抗炎药（NSAIDs）,长期应用可导致人角膜上皮细胞（HCECs）的损伤,但3种滴眼液导致HCECs的损伤程度及滴眼液中添加物的细胞毒性尚不清楚. 目的 评价双氯芬酸钠滴眼液、普拉洛芬滴眼液和溴芬酸钠滴眼液及其相应原料药对HCECs的毒性,明确其细胞毒性的主要来源. 方法 常规培养HCECs,分别在培养液中添加1∶1、1∶2、1∶5、1∶10稀释的滴眼液或原料药,使最终质量分数分别为0.10％、0.05％、0.02％和0.01％.采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测各组药物处理后HCECs的增生率;3种滴眼液均稀释至质量浓度0.002％（1∶50）,以Transwell法检测各组药物处理后HCECs迁移率;采用乳酸脱氢酶（LDH）检测法测定各组药物处理后HCECs损伤程度.结果 3种滴眼液对HCECs的毒性作用具有剂量依赖性,差异均有统计学意义（均P=0.00）,其中双氯芬酸钠滴眼液对HCECs增生、迁移和损伤影响最大,溴芬酸钠滴眼液对HCECs损伤程度最小,差异均有统计学意义（增生：F药物=20.25,P=0.00;迁移：F=103.43,P=0.00;损伤：F药物=164.16,P=0.00）.与滴眼液相比,原料药的细胞毒性作用普遍较小,其中普拉洛芬原料药对HCECs增生、迁移和损伤影响最小,差异均有统计学意义（增生：F药物=332.27,P=0.00;迁移：F=23.02,P=0.00;损伤：F药物=154.83,P=0.00）. 结论 双氯芬酸钠滴眼液、普拉洛芬滴眼液和溴芬酸钠滴眼液中以双氯芬酸钠对角膜上皮的毒性作用最大;3种药物的细胞毒性来源是添加物本身或原料药与添加物综合作用的结果.

吗替麦考酚酯纳米混悬剂的制备及其在兔眼内药动学研究

目的:研究普通吗替麦考酚酯纳米混悬剂及经壳聚糖修饰的吗替麦考酚酯纳米混悬剂在兔眼角膜粘附性、泪液和房水药物动力学特性。方法:以薄膜分散-高压乳匀法制备纳米混悬剂,并进一步选用壳聚糖修饰纳米药物粒子制得具有粘附作用、带正电荷的壳聚糖修饰型纳米混悬剂。HPLC法检测角膜粘附、泪液和房水中的吗替麦考酚酯和霉酚酸的含量。结果:混悬剂滴眼液呈米黄色乳液状,纳米混悬剂和壳聚糖修饰型纳米混悬剂药物粒子呈圆球状,粒径均一,纳米混悬剂平均粒径592 nm,多分散系数(Pdl)为0.114,Zeta为-29.6 mV,壳聚糖修饰型纳米混悬剂平均粒径442 nm,Pdl为0.096,Zeta为+45mV。与普通混悬剂滴眼液相比,纳米混悬剂的角膜粘附性、泪液和房水中药物浓度明显提高,而壳聚糖修饰型纳米混悬剂则可进一步提高角膜粘附性和泪液、房水中药物浓度。结论:纳米混悬剂可以促进和提高吗替麦考酚酯眼局部给药后角膜粘附和药物吸收,而壳聚糖修饰型纳米混悬剂可进一步促进和提高药物的角膜粘附和吸收。

关注哺乳动物晶状体再生及“晶状体干细胞”的研究

一些哺乳动物的晶状体摘出后，在囊袋存在的情况下可以再生出新的晶状体。目前普遍认为囊袋内不能被完全清除而残留的晶状体上皮细胞（LECs）是晶状体再生的来源。但是哺乳动物的晶状体再生并非晶状体发育的简单重复，残余LECs的无序增生、移行和转化会影响再生晶状体的透明性。大量研究围绕LECs异常增生的机制进行，而近年来“晶状体干细胞”理论被逐渐提出。总结国内外关于哺乳动物晶状体再生研究的现状，提出一些观点和看法，希望为临床预防后发性白内障以及对其进行药物治疗提供新的靶点和思路。

外培养组织工程细胞膜片重建眼表研究进展

角膜缘干细胞是角膜上皮细胞再生的来源,是维持眼表稳态的关键。近年来,随着对成体干细胞认识的加深以及组织工程、生物材料及细胞培养技术的发展,体外培养的细胞膜片移植,包括角膜缘和口腔黏膜上皮细胞膜片移植进行眼表重建的基础研究获得了一定的进展,在临床应用中也得到了较好的治疗效果,但对眼表重建的临床效果和移植细胞的体内转归方面仍无定性的结论。本文主要对利用组织工程技术构建的自体或异体角膜缘上皮细胞、口腔黏膜上皮细胞膜片移植重建眼表的基础研究进展、临床应用情况及移植细胞体内转归的进展进行介绍和比较,以期为该领域的研究提供有益的探索方向。

两性霉素B缓释系统治疗兔烟曲霉菌眼内炎的药效学实验研究

目的探讨两性霉素B缓释系统（AmB—DDS）玻璃体腔植入对烟曲霉菌性眼内炎的疗效、AmB-DDS的药物释放规律及最佳释药量。方法选取40只新西兰白兔作为实验动物。（1）Amb-DDS治疗烟曲霉菌性眼内炎疗效学观察：动物玻璃体腔内注入烟曲霉菌悬液，48h后随机分为5组，A组为空白对照组（6只眼），B组为空白DDS组（6只眼），C组为两性霉素B玻璃体腔内注射组（6只眼），D组为AmB—DDS250μg植入联合玻璃体切除术组（8只眼），E组为AmB—DDS500μg植入联合玻璃体切除术组（8只眼）。术后不同时间点检测前房闪辉、细胞及玻璃体混浊程度，取玻璃体腔内容物行涂片检查和真菌培养，2个月时取眼球标本行病理学检查；（2）AmB—DDS玻璃体腔内药物浓度检测：H组玻璃体切除术后植入500μg AmB—DDS1个（6只眼），术后第1、3、7天及2、4、6、8周取玻璃体液，高效液相色谱分析法检测药物浓度。结果A、B组全部发生严重眼内炎，伴眶内感染，组间比较差异无统计学意义（P〉0．05）；C、D、E组炎性反应较A、B组轻，差异有统计学意义（P≤0．005）；E组玻璃体混浊程度较C组轻，7～14d前房反应较C组轻，差异均有统计学意义（P≤0．005）；D组5只眼、E组8只眼治愈，差异有统计学意义（x^2=10．494，P=0．003）。不同时间点取玻璃体腔内容物涂片，所有标本6周内均见菌丝，真菌培养仅A、B组为阳性。病理学检查示治愈眼结构正常，感染未控制眼均萎缩，球壁结构被破坏。H组术后第1天即有释药，药物浓度迅速升高超出有效抑菌浓度，观察期内释药较平稳。结论AmB—DDS玻璃体腔内植入治疗烟曲霉菌性眼内炎安全有效，释药恒定，速率得当；以含药量为500μg的AmB—DDS治疗效果最佳。（中华腰科杂志，2007，43：546-553）

液相核酸芯片鉴定角膜常见致病真菌的初步实验研究

目的探讨建立快速鉴定角膜常见致病真菌的液相核酸芯片检测系统及其应用于真菌性角膜炎临床快速诊断的可行性。方法实验研究。设计针对5种角膜常见致病真菌（茄病镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、烟曲霉菌及黄曲霉菌）rRNA基因内转录间隔（ITS）区的种特异性探针，5’端氨基C12修饰后与不同荧光色的微球结合，建立液相核酸芯片检测系统。将目的真菌的5株标准菌株和42株角膜分离保存菌株的基因组DNA以一对真菌通用引物扩增并标记后用于杂交检测。实验中设市单一菌种榆测与多菌种混合检测的比较，以及芯片检测与琼脂糖凝胶电泳检测的比较，采用配对设计资料的t检验和Spearman等级相关分析对检测结果进行统计学分析，进而评估该检测系统的特异性、灵敏度和重复性。结果所建市的液相核酸芯片体系可在聚合酶链反应（PCR）后3h内准确将5株标准菌株鉴定至菌种的水平；42株角膜分离保存菌株单次检测阳性率达95．2％；阳件信号与背景比值位于5．6～13．3之间；单一菌种检测和5种菌种平行检测的中位荧光强度（MFI）差异无统计学意义（t=0．2524，P=0．8132）；MFI的变化与PCR产物的量呈正相关（rs=1．0000，P〈0．01）；最低检测浓度为0．94ngPCR产物，比琼脂糖凝胶电泳低40倍；4次重复检测的变异系数在1．8％-13．7％之间。结论所建立的液相芯片检测系统具有较高的特异性、灵敏度及重复性，可同时完成对5种角膜常见致病真菌的菌种检测，为液相芯片技术在临床真菌快速诊断中的应用奠定了实验基础。

二性霉素B眼内缓释系统对白色念珠菌性眼内炎影响的实验研究

目的探讨二性霉素B眼内缓释系统对兔实验性白色念珠菌性眼内炎的治疗作用及其安全性。方法缓释系统由二性霉素B和乙交酯丙交酯己内酯三元共聚物(PGLC)制成。(1)药效学实验:50只新西兰兔右眼行中央部玻璃体切除,同时眼内注射104cfu/ml白色念珠菌悬液0.1ml,构建眼内炎模型后,随机数字表法分为5组,每组10只眼。A组,眼内炎对照组;B组,空白药物载体组;C组,二性霉素B眼液滴眼组;D组,二性霉素B眼内注射组;E组,二性霉素B眼内缓释系统组。对比观察各组眼内炎性反应。高效液相色谱分析方法定期检测眼内二性霉素B浓度。(2)毒性实验:20只正常新西兰兔分为3组:正常对照组,2只眼;DDS组,眼内植入1粒含药1mg的缓释系统,10只眼;空白载体组,眼内植入空白药物载体,8只眼。分别进行视网膜电图、眼部病理学及透射电镜检查,并行肝、肾病理学检查。结果E组在各个时间点玻璃体混浊较A、B、C组均明显减轻;E组与D组玻璃体混浊在2周内无差异,其后存在差异;D组玻璃体混浊在2周内与A、B、C组存在差异,但2周后无差异;C组在各个时间点玻璃体混浊较A、B组均无显著差异。眼内植入药物缓释系统后,视网膜电图无显著改变,视网膜病理学和电镜检查以及肝、肾病理学检查未见异常改变。结论二性霉素B眼内缓释系统能够抑制白色念珠菌性眼内炎进展。PGLC缓释系统释药稳定、安全、无毒性。

脱细胞角膜基质为支架构建组织工程角膜上皮组织的实验研究

目的比较氯化钠（NaCl）-十二烷基硫酸钠（SDS）一胰蛋白酶与分散酶（Dispase）-聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-X-100）两种角膜组织脱细胞方法的效果，探讨以脱细胞角膜基质为支架构建组织工程化角膜上皮组织的可行性。方法实验研究。采用完全随机化设计的方法，分别用NaCl-SDS-胰蛋白酶和Dispase—Triton—X-100处理兔角膜组织，使用裂隙灯显微镜、光学显微镜及透射电镜观察经两种方法处理后的角膜基质特性和脱细胞效果。以兔角膜缘上皮细胞为种子细胞，Dispase—Triton—X-100处理的猪角膜前弹力层与基质为支架，体外重建兔角膜上皮细胞层，并进行形态学、组织病理学及免疫组织化学检测。结果两种方法处理过的兔角膜基质大体形态相似，灰白色不透明，水肿明显，质地柔软。组织病理学和超微形态学观察显示两种方法处理的兔角膜基质胶原排列规整，NaCl-SDS-胰蛋白酶处理的角膜组织残留了部分基质细胞碎片，而Dispase—Triton—X-100处理的角膜组织未见基质细胞碎片。兔角膜缘上皮组织块接种于脱细胞猪角膜前弹力层与基质上，24h角膜上皮细胞开始游出，3～4d融合呈片状，7—8d形成单细胞层。组织工程化角膜上皮细胞表达CK3。结论Dispase—Triton—X-100处理方法的角膜组织脱细胞效果良好。以脱细胞猪角膜前弹力层与基质为支架，可在体外构建组织工程化兔角膜上皮组织。

上皮-间质转化在眼科的研究进展

上皮-间质转化（EMT）是胚胎发育、肿瘤转移和组织修复过程中起关键作用的细胞转型机制。EMT主要表现为上皮细胞的极性、细胞间连接消失，上皮细胞表达间质成分并具有迁移的表型。在眼科疾病中，角膜细胞再生、纤维化以及创伤愈合过程存在EMT机制。EMT也是晶状体外伤、晶状体前囊混浊、后发性白内障以及增殖性玻璃体视网膜病变等疾病的重要发病机制，本文综述眼科领域中EMT机制的研究进展。

激光角膜屈光术后继发圆锥角膜的临床特征及治疗预后分析

目的分析激光角膜屈光术后继发圆锥角膜的发病特征和临床表现,并评估其治疗预后。方法回顾性病例研究。收集2013年1月至2021年12月于山东第一医科大学附属眼科医院(山东省眼科医院)就诊的激光角膜屈光术后继发圆锥角膜的患者27例(54只眼),其中男性患者22例,女性患者5例,4例单眼发病,23例双眼发病,患者年龄为19~48岁,平均(28.6±5.9)岁。分析其发病特征、临床分期、角膜地形图的参数资料、治疗方法和疗效。结果27例继发圆锥角膜患者术前的屈光手术方式为:准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK)24例,准分子激光角膜上皮瓣下磨镶术(LASEK)1例,经上皮准分子激光屈光性角膜切削术(Trans PRK)1例,飞秒激光基质透镜切除术(FLEx)1例。患者接受角膜屈光手术的年龄为15~34岁,平均(19.4±3.6)岁。27例(54只眼)患者中,潜伏期4只眼,初发期16只眼,完成期34只眼。完成期患者均表现出角膜前突变薄,8只眼(24%)可见Fleischer环、7只眼(21%)可见Vogt线。角膜地形图中角膜后表面形态表现为:初发期患者以桥型递增型(38%)和桥型递减型(25%)为主,完成期患者则以岛型(64%)和不完全岛型(18%)为主。初发期患者主要采用框架眼镜(50.0%)和透气性角膜接触镜(RGP)(31.3%)治疗,而完成期患者多数需行角膜交联术(CXL)(29.5%)或板层角膜移植术(LKP)(50.0%)手术治疗,17例接受LKP术的患者均为LASIK术后继发圆锥角膜患者。结论激光角膜屈光术后继发圆锥角膜以LASIK术后多见,初发期患者的角膜地形图后表面形态较少进展为岛型,完成期患者多数需行角膜交联术或角膜移植术手术治疗。

角膜基质细胞Nrf2-ARE信号通路活化缺陷在圆锥角膜发病中的作用

背景 氧化应激在圆锥角膜发病过程中具有重要的作用,核因子E2相关因子2-抗氧化反应元件（Nrf2-ARE）信号通路是介导细胞氧化应激反应的关键通路,但其在圆锥角膜发病中的作用及其机制鲜见报道. 目的 研究正常角膜与圆锥角膜基质细胞中Nrf2-ARE信号通路活化的区别及Nrf2-ARE通路对角膜基质降解酶表达水平的影响,探讨圆锥角膜发病的具体机制.方法 于2012年11月至2013年6月在青岛眼科医院收集圆锥角膜患者术中的角膜组织样本和正常供体角膜样本,采用中性蛋白酶和胶原蛋白酶联合消化法分离角膜基质细胞并用含质量分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养细胞,待细胞80％融合后在培养基中加入200 μmol/L H2O2处理1h以模拟氧化应激微环境.采用DCFH-DA荧光底物孵育法检测细胞内活性氧簇（ROS）含量,分别采用Western blot和实时定量PCR法检测细胞核内Nrf2mRNA及其蛋白、Nrf2-ARE信号通路下游抗氧化蛋白、尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）、uPA受体（uPAR） mRNA及其蛋白的相对表达水平,采用明胶酶谱法检测细胞中基质金属蛋白酶2（MMP-2）活性.结果 正常培养条件下,圆锥角膜基质细胞中ROS荧光强于正常角膜基质细胞,细胞核内Nrf2蛋白表达水平均明显高于正常角膜基质细胞,差异有统计学意义（t=18.155,P＜0.01）,但在H2O2处理条件下,圆锥角膜基质细胞中ROS荧光强度明显强于正常角膜基质细胞,且圆锥角膜基质细胞核内Nrf2表达水平明显低于正常培养条件下的圆锥角膜基质细胞,差异有统计学意义（t=62.123,P＜0.01）.正常培养条件下,圆锥角膜基质细胞间还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化还原酶1（NQO-1）、血红素氧合酶1（HO-1）、超氧化物歧化酶2（SOD2） mRNA及其蛋白的相对表达量明显低于正常角膜基质细胞,差异均有统计学意义（均P＜0.01）;但在H2O2培养条件下2种细胞间未见明显变化（NQO-1：t=2.209,P=0.092;HO-1：t=0.293,P=0.784;SOD2：t=0.749,P=0.495）;圆锥角膜基质细胞uPA、uPAR表达量和MMP-2活性均明显高于正常角膜基质细胞,差异均有统计学意义（t=19.164、15.458、4.818,均P＜0.01）. 结论 圆锥角膜基质细胞在Nrf2-ARE信号通路活化方面存在缺陷,且这种缺陷与其表达基质降解酶的水平密切相关,说明该通路异常可能是圆锥角膜发病的机制之一.

改良角膜表面镜片术法建立兔曲霉菌性角膜炎动物模型

背景真菌性角膜感染动物模型是研究真菌性角膜炎发病机制的工具，目前的制作方法主要有划痕法、基质注射法和角膜表面镜片术法，但均有其不足之处。目的探讨一种简便、易操作的改良兔曲霉菌性角膜炎动物模型制作方法。方法成年新西兰白兔18只，采用烟曲霉菌孢子附贴滤纸片的改良角膜表面镜片术法制作真菌性角膜炎动物模型。将浸有10^8孢子／ml（10^8孢子／ml组，6只）或10^6孢子／ml（106孢子／ml组，6只）真菌混悬液的滤纸贴敷于去上皮的角膜基质并用角膜接触镜覆盖，将浸有生理盐水的滤纸贴敷于另6只兔眼角膜作为对照组。分别于造模后3、7、14d裂隙灯下观察眼前节症状，参照Dong的标准进行症状评分。制备角膜刮片并用质量分数10％KOH和荧光白染色在荧光显微镜下检测真菌菌丝，角膜组织切片分别行苏木精-伊红和过碘酸希夫染色，光学显微镜下观察角膜形态学改变和菌丝生长情况。对感染组织进行真菌培养以验证模型的质量。结果10^8孢子／ml组和10^6孢子／ml组真菌性角膜炎模型成功者分别为6眼和4眼，裂隙灯检查表明造模3d后10^8孢子／ml组眼前节症状明显重于10^6孢子／ml组，且随着时间的延长，炎性损伤逐渐转向增生期。造模后3d和7d，2组感染的兔眼症状评分明显高于对照组，差异均有统计学意义（P〈0．01），10^8孢子／ml组兔眼的症状评分均明显高于10^6孢子／ml组，差异有统计学意义（P〈0．01），造模后14d，10^8孢子／ml组兔眼的症状评分明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05）。造模后3d和7d，2组兔眼角膜刮片中均可见真菌菌丝。角膜组织病理学检查显示，造模3d和7d后10^8孢子／ml组可见炎性细胞浸润和角膜基质细胞坏死，并可见真菌菌丝，造模后14d可见新生血管长入。10^6孢子／ml组炎症轻于10^8孢子／ml组。真菌培养结果表明，造模后3d和7d时10^8孢子／ml组均见菌丝生长，而10^6孢子／ml组仅在造模3d时可见菌丝生长。结论改良角膜表面镜片术法可成功制备兔曲霉菌性角膜炎动物模型，是一种简便、易于操作的真菌性角膜炎动物模型制作方法。

ROCK抑制剂Y-27632在角膜保存时对角膜缘干细胞活性的促进作用

背景 角膜缘干细胞（LSCs）对维持角膜上皮的稳定和角膜组织透明性有重要作用.Rho关联卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）抑制剂Y-27632能够促进人胚胎干细胞、角质上皮细胞等的增生,减少细胞凋亡.目的 探讨Y-27632对离体兔角膜保存和体外LSCs扩增能力的影响. 方法 在细胞培养基MEM中加入质量分数12.5％硫酸软骨素、质量分数10.0％低分子右旋糖酐、20.0 mg/L地塞米松、100 mg/L妥布霉素注射液、9.5 g/L Hepes,使用时添加0.375 mg/L L-谷氨酰胺,制备成角膜活性保存液.将新西兰大白兔的角膜组织片分别置于含或不含Y-27632的角膜活性保存液中保存4、7、14d,采用质量分数0.25％锥虫蓝和质量分数0.2％茜素红染色法观察角膜内皮细胞密度及形态,采用Giemsa染色法并使用Image J图像分析软件计数克隆球数量和LSCs活性,计算LSCs存活率和克隆形成效率. 结果 角膜片保存4d时,Y-27632保存液组和单纯角膜中期保存液组角膜内皮细胞形态无明显差别,角膜片保存7d时,Y-27632保存液组角膜内皮细胞形态仍保持规则的六边形,而单纯角膜中期保存液组角膜内皮细胞的细胞膜轻微皱缩,少数细胞体积变大.角膜片保存14 d时单纯角膜中期保存液组角膜内皮细胞可见较多的茜素红斑.单纯角膜中期保存液组角膜内皮细胞计数为（2 262±75）/mm2,Y-27632保存液组角膜内皮细胞计数为（2 425 ±95）/mm2,差异有统计学意义（P＜0.001）.新鲜角膜片和角膜片保存4d时,Y-27632保存液组和单纯角膜中期保存液组LSCs的克隆球均较大,其内细胞数较多,而保存7d和14 d时,与Y-27632保存液组比较,单纯角膜中期保存液组LSCs克隆球直径明显缩小.新鲜分离的角膜片和角膜片保存4d时,Y-27632保存液组与单纯角膜中期保存液组LSCs的克隆形成率和角膜上皮细胞存活率的差异均无统计学意义（均P＞0.05）;角膜片保存7d和14d时,角膜缘上皮细胞的活性率分别为（73.00±2.12）％和（56.00±0.71）％,明显高于单纯角膜中期培养液组的（66.00±4.00）％和（49.00±0.71）％,差异均有统计学意义（t=3.098,P=0.018;t=9.798,P=0.000）;角膜片保存7d和14 d时,Y-27632保存液组与单纯角膜中期保存液组LSCs的克隆形成效率分别为（11.05±0.21）％和（3.10±1.97）％,明显高于单纯角膜中期保存液组中的（2.05±1.20）％和（0.40±0.14）％,差异均有统计学意义（t=18.107,P=0.000;t=3.184,P=0.017）.结论角膜保存液中添加Y-27632可明显提高离体角膜保存的效果,同时可维持LSCs的活性及克隆形成能力.Y-27632可作为角膜保存液的有效添加成分。

三种抗生素的抗菌活性及角膜上皮细胞毒性比较

目的比较左氧氟沙星、加替沙星和莫西沙星的抗菌活性及对角膜上皮细胞的毒性作用。方法细菌与细胞共孵育1h后,抗生素处理1h,行荧光染色和CFU计数;MTT法和划痕法检测细胞的增生和迁移能力,评价3种抗生素的细胞毒性作用。结果 3种抗生素的抗菌效果均非常显著,其中莫西沙星对金黄色葡萄球菌和左氧氟沙星对绿脓杆菌的抑菌活性最强,对凝固酶阴性葡萄球菌和黏质沙雷菌的抗菌效果差异无统计学意义;在质量浓度低于125mg/L时,左氧氟沙星的毒性明显低于莫西沙星和加替沙星。结论莫西沙星、左氧氟沙星和加替沙星3种抗生素在抗菌活性和上皮细胞毒性方面存在一定差异。

神经肽P物质与神经营养性角膜病变的关系及其应用现状

神经营养性角膜病变是由多种因素损伤角膜感觉神经,导致角膜知觉减退,进而引起角膜营养障碍和炎症性改变,其常表现为复发性或持续性的角膜上皮缺损、角膜创伤愈合的延迟,产生角膜溃疡,甚至穿孔。目前临床靶向性治疗神经修复仍有一定难度。P物质作为一种神经递质,在眼部神经、角膜上皮细胞、角膜基质细胞及多种免疫细胞中广泛表达,通过启动胞内信号通路产生相应生物学功能。近年来,随着P物质相关研究增多,神经营养性角膜病变的治疗方式逐渐发生改变。本文回顾神经营养性角膜病变的临床特征及发病机制,从感染、手术及全身性疾病导致神经营养性角膜病变方面,总结神经肽P物质与神经营养性角膜病变关系及其应用前景。