基于斑马鱼模型研究木蝴蝶苷A的抗阿尔茨海默病活性和作用机制

基于六水合氯化铝诱导的斑马鱼阿尔茨海默病模型,探究木蝴蝶苷A的抗阿尔茨海默病活性及作用机制。将受精后3 d的野生型AB品系斑马鱼随机分为阴性对照组,80μmol/L六水合氯化铝模型对照组,80μmol/L六水合氯化铝与6μmol/L多奈哌齐阳性对照组,80μmol/L六水合氯化铝与不同浓度(5、10、20μmol/L)木蝴蝶苷A受试物组。斑马鱼受精后6 d,利用明暗交替行为学实验观察不同处理组斑马鱼行为差异并分析其变化;通过硫黄素S染色测定各组斑马鱼头部Aβ斑块沉积数;采用酶活测定试剂盒检测各组斑马鱼乙酰胆碱酯酶活性;以实时荧光定量PCR检测自噬相关基因(beclin1、ulk1b、ulk2和atg7)的表达变化;借助分子对接技术验证木蝴蝶苷A与自噬相关蛋白(beclin1、ulk1b、ulk2和atg7)结合的可靠性。结果表明,木蝴蝶苷A缓解了六水合氯化铝造成的斑马鱼运动障碍,降低了Aβ斑块沉积数和乙酰胆碱酯酶活性水平,使自噬相关基因的异常表达趋于正常。该研究初步揭示了木蝴蝶苷A能够缓解六水合氯化铝诱导的斑马鱼运动障碍,其机制可能与激活细胞自噬有关,这为木蝴蝶苷A的临床应用及其治疗阿尔茨海默病的相关研究提供了理论依据。

利用斑马鱼模型研究芦笋有效成分对免疫功能的调节作用

采用正常发育48 hpf的转基因斑马鱼为实验动物,以氯霉素处理引起免疫抑制,分别加入25.0~200.0 mg/L的芦笋多糖、6.25~100.00 mg/L的芦笋皂苷,处理24 h,观察各组斑马鱼的发育情况,拍照并统计斑马鱼体内中性粒细胞的数量。结果表明,氯霉素处理斑马鱼后,斑马鱼体内中性粒细胞数量减少,芦笋多糖在浓度为50.0~200.0 mg/L范围内对斑马鱼体内中性粒细胞数量减少具有明显改善作用,且具有明显的剂量依赖效应;芦笋皂苷在实验剂量范围内均显示出显著的改善作用。实验结果显示,芦笋的有效成分芦笋多糖、芦笋皂苷对斑马鱼免疫功能具有明显的调节作用。

低聚果糖和低聚异麦芽糖促进斑马鱼肠道蠕动作用的研究

探讨基于斑马鱼模型的低聚果糖及低聚异麦芽糖对肠道蠕动的促进作用.选用发育正常的5d的斑马鱼幼鱼,各实验组分别加入不同浓度的低聚果糖和低聚异麦芽糖溶液,培养24h后,在显微镜下观察其对斑马鱼肠道蠕动次数的影响.实验结果表明,125-500mg/mL的低聚果糖和低聚异麦芽糖均对斑马鱼肠道蠕动有促进作用,蠕动次数与浓度成正相关性.相同浓度条件下,低聚果糖较低聚异麦芽糖促进斑马鱼肠道蠕动的作用更明显.采用斑马鱼动物模型可实现促进肠蠕动药物的早期、快速筛选.

异烟肼对斑马鱼的发育毒性及其机制研究

目的以新型模式生物斑马鱼为模型,评价药物对斑马鱼胚胎和幼鱼发育毒性和行为学的影响。方法用不同浓度的异烟肼处理发育至6 h的斑马鱼胚胎,于给药后24,48和72 h观察幼鱼的死亡率、孵化率及形态学变化。用不同浓度的异烟肼处理发育至72 h的斑马鱼幼鱼,于给药后24,48和72 h观察幼鱼的死亡率、畸形率、体长及形态变化,分析幼鱼行为学轨迹,HE染色检测斑马鱼脏器病理学改变,并考察异烟肼对幼鱼抗氧化体系的影响。结果在斑马鱼胚胎的发育毒性实验中发现,异烟肼具有明显的胚胎致死效应和致畸效应,剂量高于16 mmol·L-1时胚胎孵化率显著降低。异烟肼对斑马鱼胚胎的发育毒性主要有卵凝结、心包囊水肿,脊柱弯曲,发育迟缓等。剂量低于4 mmmol·L-1对斑马鱼胚胎无明显的发育毒性。在斑马鱼幼鱼的发育毒性实验中发现,异烟肼对斑马鱼幼鱼的发育过程有明显的致畸作用,主要表现为脊柱弯曲、卵黄囊吸收延滞、鱼鳔缺失、胸鳍发育不全、尾部弯曲和体长减小等。异烟肼给药组幼鱼触壁反射活动和行为轨迹明显减少,运动距离、运动时间和运动次数显著降低,说明给药后幼鱼活动减少,行为受抑制。病理切片显示异烟肼导致幼鱼肝脏细胞肿胀,肝细胞核萎缩,肝脏空泡化严重,肠管壁变薄,肠绒毛受损严重,肌肉细胞发生不同程度的萎缩、坏死。异烟肼导致斑马鱼幼鱼机体ROS、MDA水平显著升高,SOD活力显著下降。实时荧光定量PCR结果显示,与抗氧化相关的基因表达水平紊乱。如SOD1和L-FABP转录水平显著下降,GSTP2和CYP3A转录水平显著上升。表明异烟肼导致斑马鱼幼鱼抗氧化能力下降,脂质过氧化严重,发生氧化应激反应。结论异烟肼对斑马鱼胚胎和幼鱼有明显的致畸作用,对幼鱼的运动行为有抑制作用,并随着浓度的增加和作用时间延长而增强。

阿司咪唑对斑马鱼心脏毒性的影响及其分子机制的研究

目的以斑马鱼作为实验动物,研究阿司咪唑的心脏毒性及其分子机制。方法选择受精后24 h(24 hours post fertilization)的AB系斑马鱼作为实验动物,分别暴露于不同浓度的阿司咪唑培养液中,处理24 h后,统计其死亡率并在显微镜下观察心脏形态的改变,记录心率变化,利用RT-q PCR技术检测心脏功能相关基因表达的改变。结果随着阿司咪唑浓度的升高,斑马鱼胚胎逐渐出现死亡、心囊水肿、心脏畸形、心率下降等情况;7种心脏功能相关基因(CAV1.3a、CAV1.3b、HCN2、HCN4、KCNH2a、KCNQ1和KCNE4)的表达均有所下调。结论阿司咪唑对斑马鱼胚胎的心脏毒性具有一定的剂量依赖性,且该心脏毒性的作用机制很可能是首先干扰心脏中各离子通道相关基因的表达,进而干扰离子通道的正常功能,最终引发心脏毒性。

斑马鱼模型在中药毒性研究中的应用进展

自20世纪90年代以来国际中药市场蓬勃发展,世界各大制药公司均投入巨资研究中药。与化学药物比较,中药一直被人们认为毒性低、安全。但若使用不当或不能保证原料制剂质量,中药仍会出现较强毒性。因此,提高中药早期毒性预测的灵敏度和可靠性已成为中药行业的迫切需求。

基于斑马鱼模型研究栀子和栀子苷醛抗血栓作用

尽管现代医学的高速发展,血栓性血管疾病,包括急性心肌梗死和缺血性脑卒中仍然是全球死亡或残疾的主要原因[1]。虽然许多突发和致命的血栓性疾病可以通过血管导管插入治疗,但在其急性期和长期预防复发性血栓栓塞,使用药物治疗如溶栓剂或抗凝剂也是必须的[2]。目前,我国迫切需要利用和开发新的动物模型及快速分析方法以进行血栓研究和抗血栓药物筛选。斑马鱼作为一种研究人类疾病理想的新型模式动物,具有养殖成本低,发育周期短,幼鱼透明易观察,产卵量大等独特优势[3],斑马鱼与人类一样具有遗传保守性,存在70%人类同源基因[4],以及拥有凝血因子、血小板受体,并对临床应用的抗凝血和抗血栓药物具有很好的反应,适合于血栓形成机制和治疗药物的评价。

吡嗪酰胺对斑马鱼胚胎发育和氧化应激效应的影响

目的本文研究吡嗪酰胺(PZA)对斑马鱼胚胎的发育毒性及其产生机制。方法采用受精后4h的斑马鱼胚胎进行吡嗪酰胺不同浓度的暴露,分别于暴露后24、48、72和96h进行死亡率、孵化率的统计。给药96h后进行斑马鱼幼鱼形态评分、行为学分析、活性氧簇(ROS)和氧化应激指标检测。结果表明吡嗪酰胺显著抑制斑马鱼胚胎孵化,导致斑马鱼幼鱼发育畸形(如卵黄囊吸收迟滞、鱼鳔缺失、心包水肿和体节模糊等),同时吡嗪酰胺的暴露造成斑马鱼幼鱼运动行为能力的降低。吡嗪酰胺的暴露能够引起斑马鱼体内ROS、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)水平的变化。结论吡嗪酰胺对斑马鱼胚胎有明显的发育毒性,并呈剂量和时间依赖性,氧化应激在吡嗪酰胺发育毒性中起着重要的作用。

斑马鱼皮肤损伤模型的建立及分子机制

目的以皮肤荧光转基因斑马鱼(ktr4:NTR-h Kik GR)为实验动物,研究长春新碱对皮肤细胞的损伤作用及其分子机制,建立皮肤损伤模型。方法取受精后24 h皮肤荧光斑马鱼胚胎,将脱膜后的胚胎分别置于0.01~0.04 mmol·L^(-1)不同浓度的长春新碱中,24 h后采用荧光显像的方法对斑马鱼皮肤荧光斑点进行计数和统计处理;同时对鱼体细胞死亡情况进行TUNEL试剂盒检测,确定其皮肤细胞死亡的水平;利用蛋白免疫印迹的方法对各组斑马鱼胚胎的caspase-3、KRT4及p53表达水平进行检测。结果在长春新碱与斑马鱼胚胎共同孵育24 h后,0.02、0.04 mmol·L^(-1)长春新碱明显引起斑马鱼荧光皮肤细胞减少(P<0.01);TUNEL检测表明,长春新碱与对照组比较能明显引起斑马鱼皮肤细胞凋亡;Western bolt分析显示,0.02、0.04 mmol·L^(-1)长春新碱能诱导斑马鱼胚胎caspase-3和p53表达增加(P<0.01),同时高浓度的长春新碱可使皮肤角蛋白KRT4表达明显减少(P<0.01)。结论利用长春新碱引起斑马鱼皮肤损伤,该局部毒性作用可作为皮肤损伤的造模新方法。

双酚芴对斑马鱼神经行为的影响及毒性作用机制

基于斑马鱼模型探究双酚芴(9,9-bis(4-hydroxyphenyl)fluorine,BHPF)诱导的神经毒性及作用机制。通过黑白箱测试、新型水槽测试和T迷宫测试开展BHPF对斑马鱼神经行为学影响的检测,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)研究BHPF神经毒性的作用机制。黑白箱测试结果显示,BHPF造成斑马鱼运动能力异常;新型水槽测试结果显示,BHPF导致斑马鱼探索行为异常;T迷宫测试结果显示,BHPF对斑马鱼学习记忆能力产生影响。qRT-PCR结果显示,BHPF可以造成斑马鱼神经发育、自噬和凋亡相关基因的异常表达。本研究揭示了BHPF可以造成斑马鱼运动能力和探索行为异常,影响学习记忆功能。BHPF通过影响神经发育、自噬和凋亡等途径诱导神经毒性。

小檗碱衍生物9-OH小檗碱的抗帕金森病活性和作用机制研究

目的:探究小檗碱衍生物9-OH小檗碱对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶盐酸盐(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine hydrochloride,MPTP)诱导的斑马鱼帕金森病(Parkinson’s disease,PD)症状是否具有缓解作用。方法:受精后1 d(day post fertilization,dpf)的斑马鱼胚胎,设置空白对照组,50μmol·L^(-1)MPTP造模组,50μmol·L^(-1)MPTP与不同质量浓度(100,300,500μmol·L^(-1))9-OH小檗碱共处理组。4 dpf时,分别观察并记录各组斑马鱼多巴胺神经元及脑部血管的发育情况;5 dpf时,监测行为学,记录各组行为学数据并分析差异,收集后检测PD相关基因表达变化,包括编码α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)的α-syn、编码E3泛素连接酶(E3 ubiquitin protein ligase,Parkin)的parkin、编码自噬相关基因5(autophagy related gene 5,Atg5)的atg5、编码微管相关蛋白1轻链3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3B,Lc3b)的lc3b。结果:MPTP造模组的斑马鱼多巴胺神经元和脑部血管出现不同程度的损伤,且出现运动迟缓、焦虑等PD状行为,与PD相关的基因表达也出现异常;而MPTP与9-OH小檗碱共处理组的斑马鱼多巴胺神经元和脑部血管的损伤得到改善,行为学能力得到恢复,且PD相关基因的表达趋于正常。结论:小檗碱衍生物9-OH小檗碱对MPTP诱导的斑马鱼帕金森病症状有缓解作用。

鳕鱼卵中磷脂提取工艺的优化

为了充分利用鳕鱼资源,提高海产品附加值,采用溶剂提取法,以乙醇液为提取溶剂,以磷脂得率及纯度为考察指标,通过单因素实验及正交实验,探讨乙醇浓度、料液比、提取次数和提取时间等四个因素对磷脂提取的影响,并制定出最优鳕鱼卵中磷脂的提取工艺。结果表明,鳕鱼卵中磷脂的最佳提取工艺条件为:以1∶10(g/m L)的料液比比例,采用乙醇浓度为90%的乙醇溶剂搅拌提取鳕鱼卵3次,每次提取6 h。该工艺成本低、方法简单、污染少、易于实现工业化。

原花青素对特非那定诱导的斑马鱼心脏损伤的保护作用

目的:研究原青花素对特非那定诱导斑马鱼的心脏损伤的保护作用,为原花青素的心脏保护作用的开发提供依据。方法:选取发育正常的48hpf(hour post fertilization)AB系斑马鱼胚胎,以0.5、1、3和5mg/L的原花青素对用特非那定(0.94mg/L)诱导斑马鱼心脏形态和功能影响的考察,在72hpf时,观察斑马鱼的心脏相关的指标,包括心脏形状、心囊大小、血液循环、血细胞在心区堆积等情况,测量斑马鱼的心率、测量静脉窦-动脉球(SV-BA)间距,以及主动脉的血流速度。结果:特非那定处理斑马鱼后,斑马鱼心脏出现了心脏形态、心率、功能等改变。原花青素达到1mg/L时可明显改善心脏泵血和全身血流速度等功能方面的作用;原花青素增加到3 mg/L时可明显缩短斑马鱼的SV-BA间距,缓解血细胞在心区堆积、心囊水肿等形态学的变化;原花青素增加至5mg/L时可明显提升斑马鱼心率。结论:原花青素对斑马鱼心脏功能损伤具有一定的保护作用,本实验为原花青素在心保护性作用药物的开发提供依据。

纳米TiO_2联合Cu^(2+)对斑马鱼胚胎发育毒性的影响

目的考察纳米TiO_2与Cu^(2+)联合暴露对斑马鱼胚胎发育毒性的影响。方法采用AB系斑马鱼为动物模型,以斑马鱼胚胎在72 hpf孵化率、96 hpf死亡率及120 hpf畸形率为指标,评价纳米TiO_2联合Cu^(2+)对斑马鱼胚胎发育的毒性作用。结果 (0.12~4)mg/L Cu^(2+)对斑马鱼胚胎具有较强的毒性作用;(0~200)mg/L纳米TiO_2对斑马鱼胚胎发育无明显影响。纳米TiO_2与Cu^(2+)联合暴露对斑马鱼胚胎有一定的发育毒性,但与单独Cu^(2+)暴露相比,斑马鱼胚胎的死亡率、畸形率明显下降,孵化率明显上升。结论纳米TiO_2联合Cu^(2+)在一定程度上降低了Cu^(2+)对斑马鱼胚胎的发育毒性作用。

海洋深层水对阿尔茨海默病斑马鱼认知障碍的干预作用

目的以斑马鱼为模型,研究海洋深层水(deep-sea water,DSW)对氯化铝(AlCl3)诱导所致阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的干预作用,初步探讨DSW防治AD的可能机制。方法采用AlCl3诱导斑马鱼成鱼建立AD模型,建模的同时给予不同硬度的DSW,通过Viewpoint斑马鱼行为分析系统和T迷宫装置观察DSW对AD斑马鱼自主活动能力和学习认知能力的影响;最后通过Western Blot检测Tau蛋白的表达及磷酸化程度。结果与空白对照组相比,AlCl3暴露的模型组斑马鱼的游行距离和最大速度显著降低,进入偏爱营养丰富区(enriched chamber,EC)的潜伏时间显著增加,而在EC区的停留时间显著降低,说明其自主活动能力、学习和空间认知能力明显受到影响,AlCl3诱导成功建立AD模型;而DSW可以提高AD斑马鱼的游行距离和速度,降低其进入EC区的潜伏时间,延长其在EC区的停留时间,并呈剂量依赖性,说明DSW可以改善AlCl3诱导所致AD斑马鱼的自主活动能力和学习认知能力。Western blot表明,DSW可以显著抑制Tau蛋白在丝氨酸(serine,Ser)396及苏氨酸(Threonine,Thr)231这2个位点的过度磷酸化。结论 DSW可以有效改善AD,其作用机制可能与抑制Tau蛋白的过度磷酸化有关。

马兜铃酸对斑马鱼肾损伤因子(KIM-1)表达的影响

采用分子定量方法检测斑马鱼(Danio rerio)幼鱼组织中KIM-1蛋白含量和基因表达水平,了解马兜铃酸处理后斑马鱼体内肾损伤因子的表达变化情况,并与幼鱼表型变化相比较,探讨KIM-1作为肾功能特异标志物在斑马鱼肾功能损伤评价中的应用价值。结果显示,马兜铃酸处理30 h后,幼鱼出现水肿,水肿发生率呈剂量依赖性特点。0.5~5.0μmol/L马兜铃酸处理组幼鱼水肿发生率与对照组差异不明显,但幼鱼KIM-1因子的蛋白含量及Kim-1基因表达水平比正常对照组显著升高,在马兜铃酸浓度为2μmol/L时达到最高。表明在肾功能损伤检测中,KIM-1是一种比表型更早发生变化的指标。