异烟肼对斑马鱼的发育毒性及其机制研究

目的以新型模式生物斑马鱼为模型,评价药物对斑马鱼胚胎和幼鱼发育毒性和行为学的影响。方法用不同浓度的异烟肼处理发育至6 h的斑马鱼胚胎,于给药后24,48和72 h观察幼鱼的死亡率、孵化率及形态学变化。用不同浓度的异烟肼处理发育至72 h的斑马鱼幼鱼,于给药后24,48和72 h观察幼鱼的死亡率、畸形率、体长及形态变化,分析幼鱼行为学轨迹,HE染色检测斑马鱼脏器病理学改变,并考察异烟肼对幼鱼抗氧化体系的影响。结果在斑马鱼胚胎的发育毒性实验中发现,异烟肼具有明显的胚胎致死效应和致畸效应,剂量高于16 mmol·L-1时胚胎孵化率显著降低。异烟肼对斑马鱼胚胎的发育毒性主要有卵凝结、心包囊水肿,脊柱弯曲,发育迟缓等。剂量低于4 mmmol·L-1对斑马鱼胚胎无明显的发育毒性。在斑马鱼幼鱼的发育毒性实验中发现,异烟肼对斑马鱼幼鱼的发育过程有明显的致畸作用,主要表现为脊柱弯曲、卵黄囊吸收延滞、鱼鳔缺失、胸鳍发育不全、尾部弯曲和体长减小等。异烟肼给药组幼鱼触壁反射活动和行为轨迹明显减少,运动距离、运动时间和运动次数显著降低,说明给药后幼鱼活动减少,行为受抑制。病理切片显示异烟肼导致幼鱼肝脏细胞肿胀,肝细胞核萎缩,肝脏空泡化严重,肠管壁变薄,肠绒毛受损严重,肌肉细胞发生不同程度的萎缩、坏死。异烟肼导致斑马鱼幼鱼机体ROS、MDA水平显著升高,SOD活力显著下降。实时荧光定量PCR结果显示,与抗氧化相关的基因表达水平紊乱。如SOD1和L-FABP转录水平显著下降,GSTP2和CYP3A转录水平显著上升。表明异烟肼导致斑马鱼幼鱼抗氧化能力下降,脂质过氧化严重,发生氧化应激反应。结论异烟肼对斑马鱼胚胎和幼鱼有明显的致畸作用,对幼鱼的运动行为有抑制作用,并随着浓度的增加和作用时间延长而增强。

斑马鱼皮肤损伤模型的建立及分子机制

目的以皮肤荧光转基因斑马鱼(ktr4:NTR-h Kik GR)为实验动物,研究长春新碱对皮肤细胞的损伤作用及其分子机制,建立皮肤损伤模型。方法取受精后24 h皮肤荧光斑马鱼胚胎,将脱膜后的胚胎分别置于0.01~0.04 mmol·L^(-1)不同浓度的长春新碱中,24 h后采用荧光显像的方法对斑马鱼皮肤荧光斑点进行计数和统计处理;同时对鱼体细胞死亡情况进行TUNEL试剂盒检测,确定其皮肤细胞死亡的水平;利用蛋白免疫印迹的方法对各组斑马鱼胚胎的caspase-3、KRT4及p53表达水平进行检测。结果在长春新碱与斑马鱼胚胎共同孵育24 h后,0.02、0.04 mmol·L^(-1)长春新碱明显引起斑马鱼荧光皮肤细胞减少(P<0.01);TUNEL检测表明,长春新碱与对照组比较能明显引起斑马鱼皮肤细胞凋亡;Western bolt分析显示,0.02、0.04 mmol·L^(-1)长春新碱能诱导斑马鱼胚胎caspase-3和p53表达增加(P<0.01),同时高浓度的长春新碱可使皮肤角蛋白KRT4表达明显减少(P<0.01)。结论利用长春新碱引起斑马鱼皮肤损伤,该局部毒性作用可作为皮肤损伤的造模新方法。