永生化猪视网膜色素上皮细胞的建立及初步应用

【目的】建立永生化猪视网膜色素上皮细胞系,为病毒学研究提供一种新的细胞材料。【方法】合成猪腺病毒3型E1基因,将其克隆至真核表达质粒pCI-neo中,构建E1基因真核表达质粒pCI-neo-E1,进行PCR和测序鉴定。提取pCI-neo-E1质粒,转染原代猪视网膜色素上皮细胞,用新霉素G418筛选猪永生化视网膜色素上皮细胞系(RPECs)。检测RPECs的角蛋白18和19,通过细胞计数测定其生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,并对其进行染色体核型分析。分别将猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV77毒株、猪圆环病毒2型(PCV2)DBN-SX07株和猪伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株接种RPECs,同时将PEDV CV77毒株接种绿猴肾细胞(Vero细胞),将PCV2 DBN-SX07株接种猪肾细胞(PK15细胞),将PRV Bartha-K61株接种仓鼠肾成纤维细胞(BHK细胞),观察细胞病变效应(CPE),并采用间接免疫荧光法测定病毒的滴度。【结果】PCR和测序结果显示,真核表达质粒pCI-neo-E1构建成功。将pCI-neo-E1转染原代猪视网膜色素上皮细胞,经G418筛选得到永生化细胞株,该细胞株表达角蛋白18和19,传代50代仍保持上皮样细胞形态,增殖活性良好,细胞周期及染色体核型特征与正常的二倍体细胞一致。PEDV CV77毒株感染猪RPECs 24 h后,CPE明显,滴度为10^(5.25)TCID_(50)/mL,低于其在Vero细胞中的滴度(10^(8.125) TCID_(50)/mL)。PCV2 DBN-SX07毒株感染猪RPECs后可产生明显CPE,病毒滴度为10^(6.125)TCID_(50)/mL,略高于其在PK15细胞上的滴度(106.0 TCID_(50)/mL)。PRV Bartha-K61毒株感染猪RPECs后,CPE明显,病毒滴度为10^(8.75)TCID_(50)/mL,略低于其在BHK上的滴度(108.875 TCID_(50)/mL)。【结论】成功构建了永生化猪视网膜细胞系,可用于猪源病毒的培养,尤其是培养PCV2可产生明显CPE,易于观察,为后续开展疫苗工艺的提升提供了一种新的细胞材料。

猪NLRP3基因Real-time PCR检测方法的建立及应用

根据NCBI NLRP3 cds(NM-001256770)序列设计1对特异性引物,构建标准品质粒pMD18T-NLRP3-189。通过反应条件优化、稳定性、敏感性等试验,成功建立了NLRP3的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法,用该方法定量检测猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)感染后的猪肺组织中NLRP3表达水平。最佳引物浓度为0.15μmol/L,建立的标准曲线方程为y=-3.5196x+36.968,E值为0.96,最低检测量为84个拷贝,熔解曲线有单一峰,批内变异系数CV为0.067%~0.184%,批间变异系数为0.221%~0.594%,重复性好。该方法检测仔猪在感染Mhp后肺组织中的NLRP3 mRNA表达水平,感染组与健康组相比差异显著(P<0.01),NLRP3表达水平明显增高,在感染后14 d可达到高峰,平均mRNA拷贝数达18000左右,可持续42 d。表明该检测方法稳定性良好,精确度高,特异性强,为进一步研究猪炎症小体NLRP3的激活及其相关炎症反应机制提供了技术支持。

鲁西地区稀土矿床成矿系列划分与找矿新突破

鲁西地区是我国重要的稀土基地,目前已发现并评价了4个稀土矿(床)点:微山县郗山特大型稀土矿、枣庄薛城关帝庙稀土矿点、兰陵龙宝山中型稀土矿、淄博—莱芜地区稀土矿点。根据近年来的研究成果,厘定出与燕山晚期岩浆有关的与构造-岩浆作用有关的稀土矿床成矿系列。根据稀土矿形成依存的构造-岩浆条件,该矿床系列形成于整个中生代,贯穿于燕山晚期,初步分为一个稀土矿成矿亚系列:与构造-岩浆及岩浆热液有关的成矿亚系列,成矿年龄110~(134.9±1.8)Ma。通过选取郗山稀土矿和胡家庄稀土矿进行同位素研究,郗山稀土矿方解石及矿体中δ^(18)O_(V-SMOW)为8.2‰~9.1‰,δ^(13)C_(V-PDB)为–7.5‰~–7.1‰,成矿物质与碱性岩浆最初可能来源于上地幔;胡家庄含稀土碳酸岩C同位素显示有幔源特征,O同位素落入海相碳酸岩和幔源碳酸岩之间,显示有海相碳酸岩特征,因此推测,方解石矿物经历过后期改造成为次生矿物,为成矿热液与围岩进行水岩反应混合后的结果,二者成矿物质来源具有幔源特征,成矿物质来源相似。根据成矿系列理论,在郗山稀土矿开展系统找矿工作,以寻找中生代郗山碱性杂岩体为找矿目标,提交特大型稀土矿床1处,取得了重大找矿突破,证实了鲁西地区具有较好的找矿前景。

鸭甲型肝炎病毒3型和鸭圆环病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立同时检测鸭甲型肝炎病毒3型(DHAV-3)和鸭圆环病毒(DuCV)的双重荧光定量PCR方法,试验根据NCBI中收录的DHAV-3 VP1和DuCV cap基因序列,分别设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了同时检测DHAV-3和DuCV的双重荧光定量PCR,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估,并采用该方法对临床样品进行检测。结果显示:建立的方法不与其他常见鸭病原发生交叉反应,对DHAV-3和DuCV的检测灵敏度分别为3.8 copies/μL和7.3 copies/μL,批内和批间变异系数均小于2%,从65份临床样品中分别检出DHAV-3和DuCV阳性样品11份和28份,与现有地方标准符合率分别为95.4%和90.8%。研究表明,建立的双重荧光定量PCR特异性强、敏感性高、重复性好,可用于DHAV-3和DuCV的快速检测。

鲁西郗山稀土矿石英正长岩元素地球化学特征及其指示意义

郗山矿床是山东最重要的稀土矿床,也是除内蒙古白云鄂博和四川牦牛坪以外的第三大稀土矿床。本文对控制该矿床稀土矿化的石英正长岩的元素地球化学特征进行了详细研究,限定了该岩石的源区特征和形成的构造背景;并通过与四川牦牛坪稀土矿床石英正长岩的对比,探讨了该矿床的成矿潜力。研究结果显示,郗山稀土矿床石英正长岩是典型的橄榄粗安岩系岩石,它与牦牛坪石英正长岩具有相似的地幔源区特征,但其地幔源区流体作用的强度/规模不如后者,这可能是造成郗山稀土矿化规模较小的原因之一。元素地球化学特征还显示,与超大型牦牛坪稀土矿床的石英正长岩一样,郗山石英正长岩的地幔源区受到碳酸盐化的影响,同样具有形成超大型碳酸岩型稀土矿矿床的潜力。

猪视网膜上皮细胞的分离培养与鉴定

旨在建立猪视网膜上皮细胞(PRECs)的分离纯化及传代培养方法。采用组织块贴壁法和消化法分离猪视网膜细胞(PRCs),经差速消化法纯化细胞,筛选确定最优培养条件并鉴定细胞生物学特性。结果:消化法分离的细胞约1周长成单层,组织块贴壁法约2周长满单层,但活力更高;PRCs主要形态为长梭形和大理石样,呈现为2种形态细胞混合生长;差速消化法纯化细胞后,经间接免疫荧光鉴定细胞角蛋白(CK18和CK19),确定该细胞为上皮细胞;细胞接种猪圆环病毒2型(PCV2)可产生明显病变。综上,本试验成功分离获得PRECs,含胎牛血清浓度为12%的α-MEM为最优培养基,该细胞支持PCV2增殖并产生明显的细胞病变,为进一步建立稳定传代的猪视网膜上皮细胞系及研究PCV2感染及致病机理提供基础。

K亚群禽白血病病毒CRISPR/Cas13a检测方法的建立及初步应用

为了快速、准确和简便地检测K亚群禽白血病病毒(ALV-K),本研究参照GenBank中ALV-K的gp85基因设计了特异的RPA引物和用于LwCas13a反应系统的crRNA,通过优化反应条件建立了检测ALV-K的CRISPR/Cas13a方法,并验证了该方法的特异性、敏感性和符合性。结果显示,该法对感染鸡的其他常见病毒的检测均为阴性,特异性良好无交叉反应;灵敏度为50 copies/μL;与PCR的检测结果有很好的符合性。本研究建立的CRISPR/Cas13a检测方法配合试纸条显色在1.5 h左右可对ALV-K进行快速的鉴别诊断,为该病的诊断及防控净化提供了强有力的技术支撑。

鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定与VP1基因序列分析

为确定发病鸭场的致病原,掌握该致病原的遗传进化特征,研究从山东省某鸭场采集到1份短喙与矮小综合征(SBDS)疑似病例病料,采用永生化鹅胚上皮细胞系(GEEC)对病料进行病毒分离培养,观察细胞病变,测定分离毒株的血凝性、病毒滴度(TCID_(50))、对鸭胚的致病性,并进行VP1基因序列比对及相似性分析。结果显示:临床病料分离培养的病毒可引起GEEC出现细胞明显皱缩、聚集、折光性增强等典型细胞病变,表明分离到一株鸭源NGPV毒株,命名为SDHZ株,该病毒对1%鸡红细胞无凝集性,TCID_(50)高达10^(-6.25)/mL,鸭胚半数致死量(ELD_(50))为10^(-4.5)/mL,接种鸭胚死亡出现全身及肝脏出血、短喙、发育迟缓等典型症状,VP1基因序列与樱桃谷鸭中分离的新型鹅细小病毒(NGPV)相似性为95.3%~98.0%,与GPV经典毒株的相似性为89.3%~94.6%。表明该鸭场本次疫病病原为NGPV,为进一步研究NGPV致病机制及制定综合防控措施提供参考。

非粮型单细胞蛋白饲料对育肥猪的饲喂效果研究

[目的]开发或利用大宗非粮型单细胞蛋白饲料资源。[方法]利用鸡粪发酵物、发酵配合饲料,按不同比例分别与常规配合饲料和自配无抗配合饲料混合,同时利用10%酿酒酵母培养物和90%常规配合饲料混合,进行育肥猪饲喂试验。通过比较各试验组与对照组的饲喂效果,探讨鸡粪发酵物和发酵自配无抗配合饲料的最佳添加比例,分析酿酒酵母培养物的饲喂效果。[结果]添加自配无抗配合饲料的试验料肉比均低于对照组;鸡粪发酵物添加试验组中,用15%鸡粪发酵物替代常规配合饲料的试验组A3料肉比最低;发酵配合饲料添加试验组中,添加20%发酵自配无抗配合饲料+80%自配无抗配合饲料的试验组B2的料肉比最低;使用10%酿酒酵母培养物替代常规配合饲料试验组C1的料肉比低于对照组。经济效益分析表明,添加鸡粪发酵物的试验组中A2组毛利润最高,添加发酵配合饲料的试验组中B2组毛利润最高。[结论]研究可为新饲料原料的开发、原料发酵处理等提供理论参考,并为实现农牧废弃资源的高效和增值利用奠定基础。

猪圆环病毒3型检测方法及感染现状概述

文章概述猪圆环病毒3型(PCV3)各种分子生物学和免疫学等实验室诊断方法的最新研究进展,并概述了我国不同地区PCV3的感染现状,对提高PCV3的综合防控能力具有一定的参考价值。

蜘蛛香活性成分萃取与颗粒制剂制备的研究综述

试验通过蜘蛛香有效成分对肠道菌群的影响,有效缓和和治疗肠易激综合症(IBS),优化蜘蛛香中生物活性成分提取工艺,研究搭建制备蜘蛛香颗粒整体制备方案。我国IBS临床类型以腹泻为主,且发病具有女性多于男性,以中青年中20~50岁为主的特点,该研究成果将有效预防IBS,降低发病率,为治疗该症状提供新途径。

鸭甲肝病毒1型和3型一步法双重RT-PCR鉴别检测方法的建立及其初步应用

为建立一种快速鉴别不同基因型鸭甲肝病毒(DHAV)的检测方法,根据DHAV-1和DHAV-3特异性序列,分别设计合成鉴别检测引物,经一步法双重RT-PCR反应条件的优化,建立了鉴别DHAV-1和DHAV-3的一步法双重RT-PCR方法,并应用该方法对2016—2021年山东地区采集的58份临床病料样品进行病原学检测分析。结果显示:该方法能够分别扩增出DHAV-1的230 bp和DHAV-3的502 bp的特异性条带,而DTMUV、NDV、AIV-H9、FADV、DEV、GPV均无任何扩增条带。该方法最低可检测到0.62 ng DHAV-1 RNA和0.59 ng DHAV-3 RNA。该方法与病毒分离方法的符合率达100%。该方法检测58份临床病料样品,共检测出阳性样品27份,阳性率达46.55%,其中2016—2021年DHAV-1阳性率分别为33.33%,25.00%,22.22%,12.50%,11.11%,0.00%;DHAV-3阳性率分别为8.33%,16.67%,22.22%,37.50%,33.33%,37.50%。表明建立的DHAV-1和DHAV-3一步法双重RT-PCR鉴别检测方法具有良好的特异性、敏感性、准确性和临床适用性;同时发现山东地区DAHV的优势流行毒株已由DHAV-1转变为DHAV-3。

鸡传染性贫血病毒CRISPR/Cas13a检测方法的建立及初步应用

为了快速、准确和简便地检测鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV),本研究参照GenBank中CIAV的VP2基因设计了特异的RPA引物和用于LwCas13a反应系统的crRNA,通过优化反应条件建立了检测CIAV的CRISPR/Cas13a方法,并验证了该方法的特异性、敏感性和复合性。结果显示,该法对感染鸡的其他常见病毒的检测均为阴性,特异性良好无交叉反应;灵敏度为50copies/μL;与PCR的检测结果有很好的符合率。本研究建立的CRISPR/Cas13a检测方法配合试纸条显色在1.5h内可对CIAV进行快速的鉴别诊断,为该病的诊断及防控净化提供了强有力的技术支撑。

猪NLRP3单克隆抗体制备及其抗原表位的鉴定

为制备猪炎症小体NLRP3的特异性单克隆抗体(monoclonal antibodies,MAb),本研究将原核表达的可溶性重组蛋白NLRP3作为免疫原免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选获得了3株能稳定分泌NLRP3蛋白的杂交瘤细胞株9H5、13E1、15E2,鉴定了抗体亚类,将目的蛋白逐步截短后鉴定出了单克隆抗体识别的抗原表位区域。结果表明,MAb 9H5和15E2识别的抗原表位序列在1~57 aa之间,MAb 13E1识别的表位序列在115~186 aa之间。免疫荧光、Western blot和亚类鉴定试验显示,杂交瘤细胞产生的抗体均可与NLRP3及重组蛋白特异性结合,9H5、13E1、15E2的重链亚型均为IgG 2b,轻链分别为λ、λ和κ链。本研究成功制备了猪NLRP3的单克隆抗体,为进一步研究猪炎症小体NLRP3的功能提供工具。

反射地震在胶东西北部变质岩区深部构造探测中的应用

焦家、三山岛、招平作为胶东西北部三大主要控矿断裂带,控制了胶西北地区近80%以上的金矿储量.金矿主要沿断裂倾角变化的平缓部位和陡、缓转折部位富集,构成了"阶梯式"分布型式.在复杂的区域地质构造背景下,如何清晰准确地预测控矿构造陡缓相间的倾角变化规律,成为金矿深部勘查必须要解决的问题.为了查明胶西北深部构造变化特征,本文应用地震方法进行了探索尝试.结合研究区以往地质、物探资料,构建了本区薄层反射地质模型,通过正演模拟研究,分析了采集参数,指导采集并获得了较高质量数据;针对变质岩区地震资料信噪比低、构造倾角大等特点,通过组合去噪、时频反褶积等技术手段,提高了地震信噪比;分析了该区地震反射波特征,以断面或蚀变带反射波直接进行断裂构造解释.明确了主要控矿构造在纵向上整体具有上陡下缓的"铲式"的特点,构造倾角30°~50°,局部达70°以上,呈倾角陡、缓相间阶梯式展布形态,且南东倾向断裂规模较北西倾向大.根据解释结果,预测了断裂带深度,指导了钻孔布设并获得了验证.