miR-34a对人牙周膜干细胞成骨分化的促进作用及其机制

目的:探讨微小RNA-34a (miR-34a)对人牙周膜干细胞(PDLSCs)成骨分化的影响,并阐明其作用机制。方法:原代分离PDLSCs,诱导PDLSCs成骨分化,收集成骨分化后第0、7和14天的PDLSCs。实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测PDLSCs成骨分化细胞中碱性磷酸酶(ALP)、Runt相关转录因子2 (Runx2)和骨钙素(OCN) mRNA表达水平,Western blotting法检测PDLSCs中解整合素金属蛋白酶10 (ADAM10)蛋白表达水平。将PDLSCs分为空白对照组、空载组和miR-34a过表达组。RT-qPCR法检测各组PDLSCs中miR-34a表达水平,双荧光素酶报告系统验证miR-34a与ADAM10基因的靶向关系,Western blotting法检测各组PDLSCs中ADAM10蛋白表达水平。成骨诱导分化后,采用茜素红染色观察各组PDLSCs中矿化结节形成情况,RT-qPCR法检测各组PDLSCs中ALP、 Runx2和OCN mRNA表达水平,比色法检测各组PDLSCs中ALP活性,Western blotting法检测各组PDLSCs中Notch1、Notch胞内结构域(NICD)和Hes1蛋白的表达水平。结果:与成骨分化第0天比较,成骨分化第7和14天PDLSCs中miR-34a、 ALP、 Runx2和OCN mRNA表达水平逐渐升高(P<0.05),而ADAM10蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05)。与对照组和空载组比较,miR-34a过表达组细胞中miR-34a表达水平明显升高(P<0.05),ADAM10蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验,PDLSCs中ADAM10是miR-34a的靶基因。与对照组和空载组比较,miR-34a过表达组PDLSCs中矿化结节形成数、ALP活性以及ALP、Runx2和OCN mRNA表达水平明显升高(P<0.05), Notch1、 NICD和Hes1蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:过表达miR-34a能通过靶向下调ADAM10进而抑制Notch信号通路活性,从而促进PDLSCs成骨分化。