双组分转导系统CNX_RS34865/CNX_RS34870对安丝菌素生物合成的调控机制研究

目的探究珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)中双组分转导系统CNX_RS34865/CNX_RS34870对A.pretiosum中安丝菌素P-3(AP-3)生物合成的调控机制。方法本研究以A.pretiosum X47菌株为出发菌株,构建双组分转导系统CNX_RS34865/CNX_RS34870中调控基因CNX_RS34870的缺失突变菌株;利用HPLC分析及生物活性测定分析出发菌株X47与CNX_RS34870突变菌株(ΔRS34870)的AP-3产量差异;利用转录组测序分析菌株之间各基因的转录水平差异,分析CNX_RS34870对菌株AP-3生物合成的影响及作用机制。结果与出发菌株X47相比,ΔRS34870菌株在液体发酵条件下AP-3生物合成量显著下降,在第6天时,ΔRS34870菌株AP-3产量降低了36.94%。转录水平分析显示ΔRS34870菌株中1524个基因的转录较X47明显不同,其中AP-3生物合成基因簇中的asm1、asm2、asm30、asm32、asm33、asm34、asm35和asm37基因以及与初级代谢中与AP-3前体合成相关的pgk基因出现了显著下调。结论CNX_RS34870是菌株AP-3生物合成的正调控基因,可通过调控AP-3生物合成基因簇的转录以及影响初级代谢从而影响AP-3的产生。本研究将为了解AP-3生物合成的调控网络以及工业菌株的遗传改造提供理论指导。

降解苯丙氨酸的工程益生菌构建及其喂养苯丙酮尿症小鼠的效果分析

苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)是一种常染色体隐性遗传病,低蛋白饮食是目前临床治疗的主要方法,而采用工程益生菌治疗尚处于研发阶段。为了探究工程益生菌对PKU的治疗效果,该研究基于大肠埃希菌Nissle 1917(EcN)菌株,构建了一株表达苯丙氨酸裂解酶的工程益生菌EcN-PAL。通过λ-Red同源重组系统在EcN中导入经优化设计的苯丙氨酸裂解酶基因,并通过体外降解实验和小鼠喂养实验验证其功能性。实验结果表明,工程益生菌EcN-PAL成功表达苯丙氨酸裂解酶,并且可降解苯丙氨酸和有效降低PKU小鼠的血液苯丙氨酸浓度。该研究成功构建的工程益生菌EcN-PAL对苯丙氨酸有良好的降解效果,动物实验证实可有效治疗PKU小鼠,为用于PKU患者的益生菌治疗奠定了基础。

替罗非班治疗高龄急性缺血性脑卒中患者经阿替普酶静脉溶栓后血管再闭塞的有效性及安全性

目的观察替罗非班治疗高龄急性缺血性脑卒中(AIS)患者经阿替普酶静脉溶栓后血管再闭塞的有效性及安全性。方法前瞻性选取2020年1月—2022年7月青岛市黄岛区中医医院神经内科收治的124例高龄AIS静脉溶栓后血管再闭塞患者作为研究对象,按照随机数字表法将患者分为常规组62例和替罗非班组62例。常规组患者予以常规治疗,替罗非班组在常规治疗基础上予以替罗非班。比较2组患者治疗7 d后美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分,治疗90 d后改良Rankin量表(mRS)评分及预后良好,出血性转化(HT)、症状性颅内出血(SICH)、病死率。结果替罗非班组患者治疗7 d后NIHSS评分及治疗90 d后mRS评分低于常规组,治疗90 d后预后良好率高于常规组(P<0.05或P<0.01)。常规组与替罗非班组患者治疗后HT、SICH发生率及病死率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论采用替罗非班治疗高龄AIS经阿替普酶静脉溶栓后血管再闭塞患者有效,可有效减轻患者神经功能及日常生活能力,且有利于改善患者预后。

应激颗粒调控镉诱导的肺上皮细胞凋亡

目的探究应激颗粒调控环境金属镉暴露诱导肺上皮细胞凋亡的生物学功能。方法将肺上皮细胞暴露于氯化镉,收集细胞进行PI/AnnexinV染色后使用流式细胞术检测氯化镉暴露后肺上皮细胞凋亡情况。通过免疫荧光实验检测应激颗粒的生成情况,Western Blot实验检测目的蛋白嘌呤霉素、真核翻译起始因子2亚基α(eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)、eIF2α磷酸化(p‑eIF2α)的表达水平。结果氯化镉暴露可以诱导肺上皮细胞发生凋亡。应激颗粒生成可抑制氯化镉诱导的肺上皮细胞凋亡。应激颗粒的形成伴随着eIF2α的磷酸化,抑制eIF2α磷酸化后应激颗粒生成减少。结论eIF2α磷酸化介导的应激颗粒形成可以调控氯化镉暴露引起的肺上皮细胞凋亡。

基于栅藻延迟发光检测的不同产地及炮制方式连翘评价方法初探

以栅藻作为生物指示剂,加入不同产地及炮制方式的中药连翘煎煮液,采用YPMS-2生物光子测量仪检测其激发延迟发光强度,采用statistica10.0软件对数值进行线性拟合,得到加入不同产地两种炮制方式的中药连翘煎煮液后的栅藻K值波动范围,验证栅藻生物指示剂法在表征中药寒热药性方面的应用效果。使用SPSS19.0分别对各组数值进行独立样本t检验,比较K值差异。结果表明,栅藻生物指示剂法可以为连翘中药材评价提供更多依据。

头霉素C基因簇大片段敲除促进克拉维酸合成

目的本研究以棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)F613-1为出发菌株,构建头霉素C基因簇中orf10、blp、lat、pcbAB和pcbC 5个完整基因片段(cep)的基因缺失突变菌株,探究头霉素C和克拉维酸(clavulanic acid,CA)生物合成的关系。方法通过生物活性测定法检测出发菌株F613-1和两株cep片段基因缺失突变菌株(△cep::apra-2和△cep::apra-4)中的头霉素C产量,同时通过HPLC检测上述菌株的生物量以及CA产量,分析头霉素C和CA生物合成之间的关系。结果与出发菌株F613-1相比,△cep::apra-2和△cep::apra-4菌株的表型没有明显变化;固体发酵168h,F613-1菌株中头霉素C产量为0.8875g/L,△cep::apra-2和△cep::apra-4菌株中的头霉素C产量均为0;液体发酵144h,突变菌株△cep::apra-2和△cep::apra-4中CA产量的分别为4.28和4.26g/L,较F613-1(3.16g/L)分别提高了35%和34%。结论在头霉素C生物合成能力缺失的情况下,CA产量明显提高,说明头霉素C和CA的生物合成存在明显的竞争作用,这对于探究CA与头霉素C生物合成之间的关系提供有力的证据,并且为提高CA产量提供新思路,对CA的工业生产有一定的指导意义。

嗜酸乳杆菌NC55的安全性评价

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)广泛应用于发酵饮品及食品领域。该实验室从发酵食品中分离获得一株嗜酸乳杆菌,将其命名为嗜酸乳杆菌NC55,该研究通过抗生素敏感实验、有害代谢产物实验及动物实验对NC55菌株进行安全性评价。结果显示,NC55菌株对多数抗生素敏感,未携带质粒,不存在耐药性通过质粒传递的可能。NC55菌株无氨基脱羧酶活性,菌株表现为不溶血。动物实验过程中小鼠生命活动正常,解剖发现主要脏器无病变,未发现细菌移位现象;致畸试验显示小鼠胚胎发育正常。综上,嗜酸乳杆菌NC55在抗生素敏感实验、质粒检测、溶血实验及动物实验中均表现出良好的安全性,可被认为是应用于人和动物的潜在有益菌株。

SLC39A13基因的泛癌分析

目的研究SLC39A13基因在人肿瘤组织内的基因及蛋白表达情况,并探究其临床意义。方法使用TIMER2.0和GEPIA2数据库探索SLC39A13基因在肿瘤组织中的表达情况。使用GEPIA2和cBioPortal数据库探索肿瘤预后情况和SLC39A13基因变异分析。使用TIME2.0探索SLC39A13表达与免疫浸润之间的关系。使用STRING,GEPIA2,Veen网站和R包进行SLC39A13相关基因的富集分析。结果SLC39A13基因在乳腺癌、宫颈癌、肝癌等组织中高表达,高表达的SLC39A13与预后不良有关的肿瘤有多形成性胶质细胞瘤、脑低级别胶质瘤、间皮瘤等。SLC39A13基因在睾丸癌、子宫肉瘤等组织中低表达,其低表达与胰腺癌的预后差有关。SLC39A13最主要的变异类型是错义突变。在结肠癌、胰腺癌、前列腺癌等6种肿瘤中SLC39A13的表达与免疫浸润呈正相关,SLC39A13的表达水平与肾乳头状细胞癌的相关成纤维细胞浸润水平呈负相关。结论通过对SLC39A13的泛癌分析表明,SLC39A13的表达与临床预后、基因突变、肿瘤细胞的免疫浸润之间存在相关性,有助于从临床角度理解SLC39A13在肿瘤发生发展中的作用,为临床诊断治疗提供帮助。

致死性发育不良Ⅰ型与成纤维细胞生长因子受体-3致病基因

致死性发育不良(TD)是一种严重的短肢侏儒症,临床上以四肢短小、胸腔狭窄、脑积水等为特征,是由成纤维细胞生长因子受体-3(FGFR3)基因突变所致。根据患者是否有弯曲的股骨,将TD分为TDⅠ和TDⅡ两种亚型,TDⅠ患者股骨弯曲,伴有或不伴有三叶草头骨,TDⅡ患者有直的股骨,均具有严重的三叶草头骨。本文主要就TDⅠ临床表现,致病基因FGFR3的结构、功能、致病机制和产前诊断的有关进展作一综述。

寡养单胞菌膜孔蛋白D0Y85_RS06780对细菌抗生素耐药性的作用研究

目的探究寡养单胞菌Stenotrophomonas sp.G4菌株中膜孔蛋白D0Y85_RS06780对抗生素耐药性的作用。方法通过氨基酸序列比对和同源建模预测D0Y85_RS06780蛋白的生物学功能;采用大肠埃希菌构建D0Y85_RS06780基因的异源表达菌株,通过检测抗生素MICs探讨D0Y85_RS06780对细菌抗生素抗性的作用,同时分析外排泵抑制剂对D0Y85_RS06780功能的影响;利用分子对接软件DiscoveryStudio的CDOCKER技术分析D0Y85_RS06780与抗生素和外排泵抑制剂的结合情况。结果同源分析表明D0Y85_RS06780为膜孔蛋白,异源表达D0Y85_RS06780导致重组大肠埃希菌具有多黏菌素和四环素抗性,外排泵抑制剂利血平能够抑制其功能,分子对接显示D0Y85_RS06780能结合多黏菌素、四环素和利血平。结论Stenotrophomonas sp.G4菌株中膜孔蛋白D0Y85_RS06780与其抗生素耐药性有关。本研究将为D0Y85_RS06780与抗生素耐药性的关联提供实验证据。

苯丙酮尿症的研究进展

苯丙酮尿症(PKU)又称高苯丙氨酸血症,是常见的单基因遗传病,是一种由功能性苯丙氨酸羟化酶(PAH)缺乏引起的先天性代谢障碍,导致患者血液和器官中苯丙氨酸(Phe)的积累。患者会出现严重的发育迟缓、神经功能缺陷和行为异常等特征。苯丙酮尿症早期筛查,能够让更多的患儿得到早期诊断,进而更早地接受治疗,最大程度上减轻苯丙氨酸对神经系统的损害。本文综述了其遗传方式、病因机制、目前预防和治疗的措施。

Hsa_circ_0008957靶MiRNA预测及其表达载体构建

目的构建Ⅰ型胶原蛋白结构基因COL1A2的靶向circRNA hsa_circ_0008957其靶向miRNA的功能。方法采用circbase软件,获取hsa_circ_0008957序列,采用PCR进行circRNA克隆,通过同源重组接入circRNA表达载体pCD2.1。重组载体pCD2.1-hCOL1A2_circ_0008957通过PCR、双酶切、Sanger测序进行验证。利用circBANK,circinteractome网站进行hsa_circ_0008957靶miRNA及其功能预测。结果pCD2.1-hCOL1A2-circ-0008957重组载体构建成功。Hsa_circ_0008957预测出该circRNA不具有蛋白编码功能,其靶miRNA hsa_miR_1305,hsa_miR_140-3p,hsa_miR_421,hsa_miR_548c_3p和hsa_miR_628-3p与成骨相关,预测hsa_circ_0008957可能通过这些miRNA参与成骨分化。结论Hsa_circ_0008957通过miR-1305、miR-140-3p、miR_421、miR_548c_3p和miR_628_3p参与成骨分化,且预测COL1A2靶向miRNA与17种miRNA取交集,得出hsa_miR_618,该miRNA与肿瘤疾病相关,为后续在细胞水平上进一步验证hsa_circ_0008957的调节功能奠定了基础。

铁基磁性纳米载体在肿瘤治疗中的应用

纳米载药在肿瘤治疗中所取得的进展推动了纳米材料在生物医学方向的发展,其中,铁基磁性纳米材料因其良好的磁学、优异的生物兼容性以及表面易于功能化修饰等优势,作为纳米载体在肿瘤治疗中得到了广泛关注和快速发展。虽然目前对Fe_(3)O_(4)磁性纳米载体有了系统性的了解,但对作为纳米载体的铁基磁性纳米粒子的全面、系统认识仍有待加强。随着肿瘤纳米递药系统设计的快速发展,亟需对铁基磁性纳米载体的制备过程和作用机理进行系统性的梳理。此外,铁死亡作为一种新型细胞死亡方式,其在肿瘤等慢性疾病的发生发展过程中的作用正逐步被重视,而铁基磁性纳米粒子在肿瘤治疗应用中对铁死亡产生怎样的影响,仍有待阐明。本综述系统介绍了铁基磁性纳米载药平台的发展、种类和制备方法,并详细总结了铁基磁性纳米粒子在肿瘤诊疗一体化中的应用,包括磁场辅助靶向、磁共振成像、磁热治疗等方面,同时对其参与Fenton反应引发铁死亡的相关机理进行了阐述。

基于学以致用教育理念的“微生物药物学”课程教学实践与思考

培养符合社会发展需要的应用型专业技术人才,提升学生的科学素养、创新意识和解决实际问题的高阶能力是高等教育专业课程教学的根本目标。“微生物药物学”是生命科学本科生和研究生的专业方向课程,为学生今后从事科学探索、应用研究和工业生产奠定理论基础和实践能力。本文基于应用导向型教学理念,就教学内容和教学体系改革进行探讨,构建“主题知识—专题讨论—项目驱动—科研训练—仿真平台—实践学习”多元化实践教学模式,并提出破解制度障碍和条件约束等困境的对策。教学评价结果表明,学生对课程的教学效果和教学方式持肯定态度,实现了“学以致用”的教学目标,为加强应用型微生物学课程建设提供了参考。

拟无枝酸菌属次级代谢潜能分析及代表菌株基因编辑体系建立

【背景】拟无枝酸菌属作为一类重要的稀有放线菌,是抗菌、抗癌类药物的重要来源,其合成天然产物的潜能尚待系统分析及发掘。【目的】揭示拟无枝酸菌属不同结构类型次级代谢产物合成潜能,并建立两个代表性菌株的遗传操作体系,为结构新颖或生物活性优良的次级代谢产物发掘及研究提供条件。【方法】使用多位点序列分析(multi-locus sequence analysis,MLSA)方法评价已公布的拟无枝酸菌基因组之间的相似度。同时,使用antiSMASH分析所有基因组的基因簇,预测其合成产物结构信息,并利用BiG-SCAPE对基因簇进行聚类分析。利用pSET152整合载体优化两个代表性拟无枝酸菌的接合转移条件,以建立遗传操作体系。采用CRISPR-cBEST碱基编辑和传统的同源重组确定靶基因失活方案。【结果】146个拟无枝酸菌基因组的生物信息学分析显示,平均每个基因组中含有33个基因簇。其中聚肽、聚酮及萜类合成基因簇的丰度较高,并且大多数基因簇与已知化合物基因簇不同。成功确定了拟无枝酸菌属两个代表菌株的最适接合转移条件。尽管CRISPR基因编辑质粒能够转入拟无枝酸菌,但6个载体均未成功编辑目标基因,而利用传统同源重组方法则成功敲除目标基因,建立了目的基因敲除系统。【结论】次级代谢潜能分析显示拟无枝酸菌属中蕴含丰富的新颖天然产物资源。此外,成功建立的基因编辑体系实现了外源基因整合及内源基因敲除,为该属新颖次级代谢产物的挖掘及生物合成研究提供了坚实的研究基础。

莫西霉素高产菌株的构建

【背景】莫西霉素(kirromycin)是由山丘链霉菌(Streptomyces collinus)Tü365产生的一种复杂线性聚酮-非核糖体肽类化合物,可与细菌延伸因子EF-Tu相互作用,阻碍蛋白质合成,具有窄谱抑菌活性。目前莫西霉素作为实验试剂用于核糖体结构和功能研究。近年来有研究报道,莫西霉素及其类似物抗沃尔巴克氏体(Wolbachia)活性优于注册药物多西环素,有望成为治疗丝状线虫感染的新先导化合物。【目的】运用组合代谢工程方法,构建莫西霉素高产菌株,实现莫西霉素产量的提升。【方法】基于莫西霉素生物合成基因簇以及生物合成途径分析,利用组成型启动子kasOp*过表达或组合过表达莫西霉素生物合成基因簇内的巴豆酰辅酶A还原酶编码基因kirN、天冬氨酸-1-脱羧酶编码基因kirD、磷酸泛酰巯基乙胺转移酶编码基因kirP、转运蛋白超家族外排泵编码基因kirTI和kirTII、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)中乙酰辅酶A羧化酶编码基因acc等,实现莫西霉素产量的提升。【结果】过表达/组合过表达上述基因对莫西霉素产量均有一定提升效果,其中,单独过表达acc及组合过表达kirD、kirN、kirP、kirTI和kirTII的效果更好,莫西霉素产量较野生型菌株分别提高了57.8%和65.6%,达到198.3 mg/L和208.1 mg/L。此外,通过在公开的细菌基因组数据库中搜索莫西霉素生物合成酶的同源蛋白编码基因,发现31个预测可以合成莫西霉素类天然产物的生物合成基因簇。【结论】本研究运用代谢工程方法有效提升了莫西霉素的产量,为进一步推动莫西霉素的应用开发奠定了基础。

龟裂霉素新产生菌株的鉴定及其产量优化

【背景】龟裂霉素(rimocidin)是一种具有广谱抗真菌活性的四烯大环内酯类化合物,对多种真菌性植物病害具有较强的防治作用,因此具有开发成农用抗生素药物的潜力。目前已经陆续发现几株链霉菌可以生产龟裂霉素,如龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)M527,但是龟裂霉素的低产量仍限制其在农用抗生素方面的开发。【目的】系统揭示链霉菌基因组中龟裂霉素生物合成基因簇(rim基因簇)的分布及特征,发现新的龟裂霉素生产菌株,并基于基因工程等策略提高其产量。【方法】采用BLASTp在链霉菌基因组中搜索龟裂霉素已知生物合成酶的同源蛋白,进一步筛选出预测可合成龟裂霉素的基因簇及所在菌株。使用多位点序列分析方法(multi-locus sequence analysis,MLSA)评价含有龟裂霉素生物合成基因簇的菌株的进化关系。基于代谢产物分析鉴定新的龟裂霉素生产菌株,并通过筛选发酵培养基和过表达调控蛋白RimoR2来提高龟裂霉素的产量。【结果】共发掘获得36个新的含有龟裂霉素生物合成基因簇的链霉菌菌株。并通过培养基筛选、发酵及代谢产物分析等证实其中的白色链霉菌(Streptomyces albofaciens)JCM 4342能够合成龟裂霉素及其类似物CE-108。经过培养基优化的龟裂霉素产量为172.5 mg/L。此外,过表达调控蛋白RimoR2后龟裂霉素的产量较出发菌株提高了2.3倍,达到397.1 mg/L。【结论】本研究系统分析了链霉菌中龟裂霉素生物合成基因簇及其所在菌株的分布特点,并通过实验证实其中的S.albofaciens JCM 4342能够合成龟裂霉素及其类似物CE-108。此外,通过基因工程方法实现了龟裂霉素产量的提高。本研究为构建更优的龟裂霉素高产菌株提供了新的元件、菌株和理论基础,将有助于推动龟裂霉素的进一步应用开发研究。

肝气郁滞型三阴性乳腺癌伴肝转移小鼠模型的构建与效果评价

目的以乳腺癌原位移植模型为基础,通过慢性不可预知性应激联合孤养法构建肝气郁滞型三阴性乳腺癌伴肝转移小鼠模型。方法采用随机数字表法将6周龄BALB/c雌性小鼠40只分为4组,每组10只:对照组,正常饲养2周后予以乳腺垫接种4T1-luc乳腺癌细胞株,后期不给于刺激处理;模型组,慢性不可预知性应激(CUS)联合孤养;6-羟基多巴胺组(6-OHDA组),CUS联合孤养+6-OHDA;解郁消癥颗粒组,CUS联合孤养+解郁消癥颗粒。观察对比各组小鼠一般状况、旷场试验、蔗糖水偏嗜实验、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、皮质酮(CORT)及去甲肾上腺素(NE)水平、肝脏HE染色和肝转移细胞凋亡水平,并行小鼠活体成像检测感兴趣区域(ROI)肿瘤荧光强度,磁共振成像检测肝脏转移灶数量。结果对照组、模型组、解郁消癥颗粒组和6-OHDA组糖水偏好、旷场试验中心区域的活动距离和穿梭次数得分,组间比较差异均有统计学意义(F=0.34,P<0.01;F=363.90,P<0.01;F=0.046,P<0.001)。模型组糖水偏好低于对照组,活动距离低于解郁消癥颗粒组,穿梭次数低于解郁消癥颗粒组,均P<0.01。对照组、模型组、解郁消癥颗粒组和6-OHDA组中血清CRH、CORT和NE表达量组间比较差异均有统计学意义(F=2501.00,P<0.01;F=155.30,P<0.001;F=149.80,P<0.01)。模型组CRH、CORT和NE表达量(87.71±5.33,198.90±5.64,371.00±16.08)均高于解郁消癥颗粒组(48.87±3.33,156.00±5.60,262.90±7.98),均P<0.01。解郁消癥颗粒组与模型组比较,ROI区域减少,肝转移数量减少,乳腺癌肝转移细胞凋亡指数增加,均P<0.01。结论以乳腺癌原位移植小鼠模型为基础,应用CUS联合孤养法能够良好模拟三阴性乳腺癌伴肝转移肝气郁滞证,可为探索肝气郁滞在三阴性乳腺癌伴肝转移中的证候实质及相关治疗药物的药理机制提供实验载体。

ABC转运蛋白SgnA/B促进纳他霉素胞外转运与高产

纳他霉素是一种天然、广谱、高效的多烯大环内酯类还原性抗真菌剂,广泛应用于食品真菌污染的防治和临床真菌感染的治疗。纳他霉素胞外转运效率可能是限制褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)发酵高产纳他霉素的重要因素。通过生物信息学及分子对接技术分析纳他霉素胞外转运蛋白SgnA/B,发现SgnA和SgnB两个异源二聚体组成的ABC转运蛋白是内向开口构象的转运蛋白,且2个结合位点与纳他霉素结合能力有强弱差异,更有利于纳他霉素的胞外转运。本研究以纳他霉素生产菌株——褐黄孢链霉菌F607为出发菌株,构建了sgnA/B基因超表达菌株F-EX,以分析sgn A/B基因超表达对纳他霉素合成及胞外转运的影响。研究发现,纳他霉素对数合成期的F-EX菌株不仅提高了纳他霉素胞外/胞内比,其120 h发酵总产量也提高了12.5%,达到7.38 g/L。最后,通过转录组测序发现,sgnA/B基因超表达除提高纳他霉素胞外转运效率外,还影响了与多种氨基酸、丙酸盐、糖、五碳化合物代谢和TCA循环相关基因的表达。研究表明,强化纳他霉素胞外转运有利于纳他霉素的合成,是提高褐黄孢链霉菌纳他霉素产量的有效策略,并为纳他霉素工业生产提供了一株具有良好应用前景的菌株。

TXNDC5-Prx2途径对前列腺癌细胞耐药性的调控

目的研究硫氧还原蛋白5(TXNDC5)-过氧化物还原酶2(Prx2)对前列腺癌细胞耐药性的影响。方法体外培养前列腺癌PC3细胞,采用化疗药物环磷酰胺(5、10、15μmol/L)干预24 h,另设空白对照组,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质印迹法检测PC3细胞中TXNDC5的表达水平。在PC3细胞中给予不同浓度环磷酰胺处理的同时沉默TXNDC5,CCK-8法检测siTXNDC5组和siNC组细胞增殖活力,活性氧检测试剂盒测定活性氧自由基含量。在PC3细胞株及其环磷酰胺耐药细胞株中给予10μmol/L环磷酰胺处理并同时沉默TXNDC5表达,检测细胞增殖活力。蛋白质印迹法检测在PC3细胞中沉默TXNDC5对Prx2蛋白表达的影响。在过表达TXNDC5的PC3细胞中沉默Prx2表达,检测Vec-Ctrl组、pcTXNDC5组、siNC组、siPrx2组、pcTXNDC5+siPrx2组的细胞增殖活力和活性氧自由基含量。结果与空白对照组相比,环磷酰胺处理可显著提高前列腺癌PC3细胞中TXNDC5 mRNA和蛋白的表达量。10、15μmol/L环磷酰胺处理PC3细胞12 h后,与siNC组相比,siTXNDC5组细胞增殖活力明显受抑(0.44±0.08vs.0.74±0.10,t=3.647,P=0.031;0.30±0.04vs.0.53±0.06,t=6.115,P=0.006)。10μmol/L环磷酰胺处理PC3细胞6、12 h,与siNC组相比,siTXNDC5组细胞内活性氧自由基的生成量显著增加(2.68±0.19vs.1.58±0.26,t=-6.027,P=0.005;4.56±0.37vs.2.73±0.26,t=-6.995,P=0.003)。采用10μmol/L环磷酰胺处理PC3及其耐药细胞株12 h,与siNC组相比,siTXNDC5组细胞增殖活力均明显受抑。蛋白质印迹法结果表明沉默TXNDC5可显著抑制Prx2的表达。沉默Prx2表达可显著抑制因TXNDC5过表达导致的细胞增殖活力升高和活性氧自由基含量降低的趋势。10μmol/L环磷酰胺处理PC3细胞12 h,Vec-Ctrl组、pcTXNDC5组、siNC组、siPrx2组和pcTXNDC5+siPrx2组细胞增殖活力分别为0.52±0.07、0.69±0.03、0.56±0.05、0.43±0.05、0.58±0.07,差异有统计学意义(F=8.868,P=0.003),pcTXNDC5+siPrx2组细胞增殖活性低于pcTXNDC5组(P=0.045);上述5组细胞活性氧自由基含量分别为3.26±0.46、2.09±0.49、3.16±0.38、4.62±0.26、2.87±0.36,差异有统计学意义(F=16.037,P<0.001),pcTXNDC5+siPrx2组活性氧自由基含量高于pcTXNDC5组(P=0.036)。结论TXNDC5可通过调控Prx2的表达,降低前列腺癌细胞中活性氧自由基的水平,从而增强前列腺癌细胞对化疗药物的耐药性。