小窝在G蛋白偶联雌激素受体调控小鼠主动脉内皮细胞一氧化氮合酶活性中的作用

目的探讨小窝(caveolae)对雌激素通过G蛋白偶联雌激素受体(GPER)调控小鼠主动脉内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性的影响。方法当细胞融合度达到80%~90%时,选取内皮细胞分为对照1组、DMSO组、雌二醇1组、雌二醇2组、雌二醇3组(n=5),其中雌二醇1组、雌二醇2组、雌二醇3组按浓度梯度加入雌二醇(10、50、100 nmol/L),对照1组不予任何处理,DMSO组加入50μl DMSO培养。另选取内皮细胞分为对照2组(未作任何处理)、阴性对照1组[加入小窝蛋白1(Cav-1)阴性对照干扰RNA]、Cav-1敲减组(加入Cav-1干扰RNA);选取部分内皮细胞设对照3组(未作任何处理)、阴性对照2组(加入GPER阴性对照干扰RNA)、GPER敲减组(加入GPER干扰RNA)。检测Cav-1、GPER、eNOS、磷酸化eNOS(p-eNOS)蛋白表达。结果与对照1组比较,雌二醇3组p-eNOS蛋白表达明显增加(0.47±0.07 vs 0.20±0.04,P<0.05)。对照2组、阴性对照1组、Cav-1敲减组GPER、eNOS、Cav-1蛋白表达比较,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。与对照2组比较,Cav-1敲减组GPER、eNOS、Cav-1蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01)。对照3组、阴性对照2组、GPER敲减组eNOS、p-eNOS表达比较,无统计学差异(P>0.05)。与对照3组比较,GPER敲减组GPER蛋白表达明显降低(0.56±0.22 vs 2.40±0.65,P<0.05)。结论小窝参与了雌激素通过GPER调控小鼠主动脉eNOS活性的过程。

黄柏酮对肺癌细胞核糖体合成、增殖的影响及机制

目的探讨黄柏酮对非小细胞肺癌细胞(A549细胞)增殖的影响及潜在的作用机制。方法常规培养A549细胞,将对数生长期A549细胞随机分为对照组、黄柏酮组,分别加入DMSO溶剂、50μmol/L黄柏酮继续培养。用尿嘧啶核苷类似物(EU)标记法检测细胞核糖体RNA(rRNA)合成,用胸腺嘧啶核苷类似物(EdU)标记法检测细胞增殖能力,用实时荧光定量PCR检测细胞中rRNA(5.8S rRNA、18S rRNA、28S rRNA、45S pre-rRNA)表达,用West‑ern blotting法检测细胞中磷酸化的雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、磷酸化的S6核糖体蛋白235/236[p-RPS6(235/236)]、p-RPS6(240/244)蛋白表达。结果黄柏酮组荧光信号强度与对照组荧光信号强度的比值为0.684±0.008(P<0.05)。与对照组比较,黄柏桐组EdU阳性细胞率低,5.8S rRNA、18S rRNA、28S rRNA、前体45S rRNA相对表达量低,p-mTOR、p-RPS6(235/236)、p-RPS6(240/244)蛋白相对表达量低(P均<0.05)。结论黄柏酮可抑制肺癌细胞核糖体合成及增殖,其作用机制可能与抑制mTOR/RPS6信号通路激活有关。

TGF-β诱导肺脏癌相关成纤维细胞高表达IL-17D并促进MDSC募集

目的:探讨TGF-β诱导肺脏癌相关成纤维细胞(CAF)表达IL-17D,并促进骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)募集的关键机制。方法:采用C57BL/6小鼠建立B16黑色素瘤细胞肺癌转移模型(肿瘤模型组),另设对照组,每组6只。应用流式细胞术(FACS)检测肿瘤小鼠肺脏CAF及其分泌IL-17D能力和MDSC比例的变化;采用ELISA和RT-qPCR检测肺肿瘤TGF-β水平的改变;FACS分选肺脏成纤维细胞,采用RT-PCR技术检测TGF-β对成纤维细胞分泌IL-17D、CCL2和CCL7的影响;Transwell检测TGF-β处理的肺脏成纤维细胞对MDSC的趋化作用。结果:肿瘤模型组肺脏CAF(CD45^(-)CD326^(-)CD31^(-))比例显著高于对照组[(28.02±2.23)%vs.(7.35±2.14)%,t=9.956,P<0.001]。肿瘤模型组中CAF分泌IL-17D的能力较对照组显著升高[(38.27±2.93)%vs.(19.04±3.16)%,t=5.995,P=0.001];肿瘤模型组肺脏MDSC比例明显高于对照组[(12.93±1.27)%vs.(8.21±1.40)%,t=4.804,P=0.009]。与对照组相比,肿瘤模型组肺脏TGF-β蛋白水平和转录水平均明显升高[(1685.07±135.61)ng/L vs.(1047.98±68.50)ng/L,t=5.051,P=0.002;2.17±0.03 vs.1.00±0.05,t=51.237,P<0.001]。肺脏成纤维细胞经不同浓度TGF-β(0、5、10μg/L)分别处理24 h后,其IL-17D mRNA相对表达量分别为0.42±0.01、0.67±0.01、0.84±0.04,CCL2 mRNA相对表达量分别为0.89±0.08、1.08±0.04、1.19±0.01,CCL7 mRNA相对表达量分别为0.53±0.05、0.65±0.04、0.74±0.03,随着TGF-β浓度升高,成纤维细胞IL-17D、CCL2、CCL7表达水平明显升高(F=57.384,P<0.001;F=15.802,P=0.004;F=14.544,P=0.005)。另外,与对照组相比(TGF-β为0μg/L),肺脏成纤维细胞经10μg/L TGF-β处理24 h后,可促进肿瘤小鼠脾脏MDSC的迁移[(9.59±0.21)%vs.(2.14±0.24)%,t=6.585,P<0.001]。结论:肿瘤微环境中TGF-β诱导肺脏CAF高表达IL-17D,是促进CCL2、CCL7表达和MDSC迁移的重要因素。

BMXΔN通过ERK/MAPK信号通路影响肺癌细胞对吉非替尼的耐药性

目的:探讨一种BMX可变剪切体BMXΔN参与肺癌表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)吉非替尼耐药的作用机制。方法:利用慢病毒感染携带EGFR突变的人肺癌细胞株PC9和HCC827构建BMXΔN稳转细胞株。实验分为PC9-Vec组(阴性对照转染空载体PC9细胞)、PC9-BMX组(稳定表达BMX的PC9细胞)、PC9-BMXΔN组(稳定表达BMXΔN的PC9细胞)以及HCC827-Vec组(阴性对照转染空载体HCC827细胞)、HCC827-BMXΔN组(稳定表达BMXΔN的HCC827细胞)。采用实时定量PCR检测细胞中mRNA表达水平;采用蛋白质印迹法检测细胞中蛋白表达水平;0 nmol/L、0.01 nmol/L、2.00 nmol/L、50.00 nmol/L、100.00 nmol/L、200.00 nmol/L、2.00μmol/L、4.00μmol/L吉非替尼处理PC9-Vec组和PC9-BMXΔN组细胞,0 nmol/L、0.01 nmol/L、1.00 nmol/L、10.00 nmol/L、100.00 nmol/L、1.00μmol/L吉非替尼处理HCC827-Vec组和HCC827-BMXΔN组细胞,采用MTT法检测细胞活力。结果:PC9-BMXΔN组细胞散落并呈现成纤维样形态。与PC9-Vec组细胞相比,PC9-BMXΔN组细胞中纤连蛋白、神经钙黏素、波形蛋白、Snail、Slug和TWIST 2的mRNA表达均上调。与PC9-Vec组和PC9-BMX组细胞相比,PC9-BMXΔN组细胞中纤连蛋白和波形蛋白表达均上调,上皮钙黏素的表达下调。与PC9-Vec组细胞相比,经0.01 nmol/L[(99.11±2.16)%vs.(91.29±1.91)%,t=-4.701,P=0.011]、2.00 nmol/L[(80.41±1.48)%vs.(63.36±2.14)%,t=-11.324,P<0.001]、50.00 nmol/L[(80.83±5.38)%vs.(60.22±3.61)%,t=-5.507,P=0.005]、100.00 nmol/L[(75.54±3.46)%vs.(59.93±1.91)%,t=-6.836,P=0.002]、200.00 nmol/L[(77.57±6.53)%vs.(56.70±2.88)%,t=-5.064,P=0.007]、2.00μmol/L[(70.22±3.45)%vs.(53.14±0.89)%,t=-8.309,P=0.001]、4.00μmol/L[(68.66±4.67)%vs.(52.30±2.59)%,t=-4.882,P=0.008]浓度吉非替尼处理的PC9-BMXΔN组细胞活力均显著升高,差异均有统计学意义;与HCC827-Vec组相比,经1.00 nmol/L[(64.36±2.49)%vs.(47.13±4.21)%,t=-7.067,P=0.019]、10.00 nmol/L[(63.25±5.87)%vs.(43.28±2.95)%,t=-5.267,P=0.006]、100.00 nmol/L[(49.47±5.74)%vs.(37.12±4.92)%,t=-2.830,P=0.047]、1.00μmol/L[(49.05±3.34)%vs.(32.06±4.73)%,t=-5.073,P=0.007]吉非替尼处理的HCC827-BMXΔN组细胞活力均显著升高,差异均具有统计学意义。吉非替尼处理明显抑制了PC9-Vec组、PC9-BXM组和PC9-BMXΔN组细胞中p-EGFR和p-ERK1/2的表达;与PC9-Vec组(0.81±0.04)和PC9-BXM组(0.80±0.05)相比,PC9-BMXΔN组细胞p-EGFR的表达水平经吉非替尼处理8 h后(0.91±0.04)显著升高(均P<0.05);p-ERK1/2的表达经吉非替尼处理2 h后(0.64±0.06 vs.0.38±0.12 vs.0.37±0.14)、4 h(1.28±0.06 vs.1.08±0.06 vs.1.11±0.07)、8 h(0.75±0.04 vs.0.55±0.05 vs.0.60±0.07)均显著升高,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。结论:BMXΔN参与了肺癌EGFR-TKI吉非替尼耐药,可能是通过诱导细胞发生上皮间质转化和激活ERK/MAPK通路实现的。