重组人白细胞介素18的纯化及其生物学活性研究

目的 :纯化rhIL 18并对其生物学功能进行初步研究。方法 :采用优化的包涵体提取技术和SephacrylS 2 0 0分子筛层析纯化rhIL 18,利用MTT染色法研究rhIL 18对NK细胞促杀伤作用和对外周血单个核细胞 (PBMC)的促增殖作用 ,采用半定量RT PCR方法研究rhIL 18诱导IFN γ基因的表达情况。结果 :得到纯度达 96 %的纯品rhIL 18,复性的rhIL 18可以明显地促进PBMC增殖 ,增强NK细胞细胞毒活性。结论 :得到纯度较高、具有较好生物学功能的rhIL 18。

人Leptin的高效表达、纯化及生物学活性研究

将人Leptin表达质粒pBV200-OB转化宿主菌E.coli JM109,热诱导获得目的蛋白的表达。经SDS-PAGE鉴定分析,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的40％以上,且以包涵体的形式表达。通过包涵体分离,Sephacryl S200HR凝胶和DEAE52离子交换层析及Hypersil C18柱反相色谱纯化,获得纯度在95％以上,内毒素含量小于10EU/Mg的高纯度的重组人Leptin。Western-blot鉴定表明,纯化表达产物能和抗Leptin抗体特异结合;蛋白质N端15个氨基酸序列分析结果和预期的序列一致。纯化产物经复性处理,其分子中Cys96和Cys146形成二硫键。体内活性检测显示,纯化和复性的rh-Leptin明显抑制BALB/c小鼠的进食和体重增长,提示其具有明显的生物学活性。

人瘦素的基因克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的 构建重组人瘦素哺乳细胞表达载体并在COS 7细胞表达重组人瘦素。方法 提取脂肪细胞总RNA ,用RT PCR扩增人瘦素cDNA并克隆至载体 pUCm T ,并对克隆基因进行DNA序列分析。以克隆的人瘦素cDNA为模板 ,用特异引物扩增瘦素基因 ,经KpnI和BamHI酶切 ,插入相应酶切的哺乳细胞表达载体pcDNA3 ,构建重组哺乳细胞表达载体并转染COS 7细胞 ,RT PCR和Western印迹检测其在COS 7细胞中的表达。结果 RT PCR扩增的DNA片断和预期的人瘦素cDNA大小一致 ;序列分析显示 ,克隆的基因序列和文献报道的人瘦素基因序列一致 ;经RT PCR和Western印迹鉴定 ,转染的COS 7细胞可表达、分泌人瘦素。结论 构建了人瘦素的哺乳动物细胞表达载体 ,并成功地在COS 7细胞中获得重组人瘦素的分泌表达。