猪圆环病毒2型感染树突状细胞外泌体中差异miRNA分析

[目的]本研究旨在探究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染中,树突状细胞(Dendritic cell,DC)外泌体miRNA在调节免疫反应中的作用。[方法]以正常的单核细胞来源树突状细胞(MoDC)来源外泌体(DEX)为空白对照组,病毒感染的MoDC来源外泌体(VDEX)为试验组,使用间接免疫荧光评估感染模型鉴定外泌体后,通过高通量测序技术分析两者中的差异miRNA。[结果]间接免疫荧光结果显示,与PCV2共孵育的MoDC中有特异性绿色荧光,表明PCV2感染MoDC模型建立成功。纳米颗粒追踪技术结果显示,超速离心法提取的外泌体直径分别为130 nm和120 nm。Western blot结果显示,两组外泌体均存在特异性标记蛋白CD63和TSG101。高通量测序结果显示,与DEX组相比,VDEX组共504种miRNA发生显著变化(P<0.05),其中161种表达上调,343种表达下调。qPCR结果表明,与DEX相比,VDEX中sscmiR10b、sscmiR199a3pR1、sscmiR5325p、sscmiR4255p、sscmiR210、sscmiR144R+1、ssclet7c、sscmiR107R2、sscmiR225pR1和sscmiR2963pR+1表达量显著下降(P<0.05),与测序结果一致。GO分析显示,差异靶基因参与的生物学功能主要有转录调控(DNA模板)、RNA聚合酶Ⅱ对转录的正/负调控、信号转导和氧化还原等过程。KEGG通路分析发现,差异靶基因主要参与T细胞受体信号通路、Th17细胞分化通路、癌症通路、细胞内吞作用和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路等。通过差异miRNA显著性P值、Foldchange和KEGG富集分析,最终确定出个10目标miRNA。[结论]VDEX中差异性表达的miRNA及其靶基因通过调控T细胞的增殖分化来调节免疫反应。

基于网络药理学和分子对接分析野黄芩苷抗卵泡闭锁的作用机制

【目的】基于网络药理学和分子对接方法探讨野黄芩苷抗卵泡闭锁的作用机制,以筛选野黄芩苷抗玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)致颗粒细胞损伤的作用途径。【方法】利用PharmMapper、TCMSP、SymMap和GeneCards数据库获得野黄芩苷发挥抗卵泡闭锁作用的靶点,使用Cytoscape v 3.7.2软件构建靶蛋白互作网络关系图并筛选关键靶点;利用DAVID数据库对靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析,构建药物-靶点-通路网络图;使用AutoDock Tools 1.5.6软件进行分子对接验证。【结果】共获得34个交集靶点,筛选得到胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)、丝裂原活化激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)、血管紧张素原(angiotensinogen,AGT)、G1/S-特异性周期蛋白-D1(G1/S-specific cyclin-D1,CCND1)、纤连蛋白1(fibronectin 1,FN1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、半胱天冬酶-3(caspase-3,CASP3)、神经源性基因位点切口同源物蛋白1(neurogenic locus notch homolog protein 1,NOTCH1)和白细胞介素6(interleukin 6,IL6)共9个核心靶点。GO功能富集分析得到基因表达调控、细胞增殖正调控、凋亡过程负调控等264个生物过程条目;线粒体、内质网、细胞质等25个细胞组分条目;生长因子活性、蛋白质结合、细胞外基质结构组成等23个分子功能条目。KEGG通路富集分析得到癌症通路、IL17信号通路、PI3K-Akt信号通路等115条相关通路。分子对接验证结果显示,野黄芩苷与9个核心靶点蛋白的结合能均<0 kJ/mol,说明蛋白可与野黄芩苷自发结合。【结论】野黄芩苷可能通过多靶点、多通路来治疗卵泡闭锁,本研究结果可为阐明野黄芩苷抗ZEA致颗粒细胞损伤的作用机制提供思路。

基于网络药理学和分子对接探讨莪术醇抗脑心肌炎病毒的作用机制

【目的】利用网络药理学和分子对接技术发现莪术醇抗脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)的作用靶点及机制。【方法】利用PharmMapper、GeneCards数据库获得莪术醇抗EMCV的相关靶点;通过Cytoscape 3.7.2软件、STRING和DAVID数据库构建靶蛋白互作(PPI)网络并筛选关键靶点,对靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析,并构建莪术醇抗EMCV靶点-通路网络;通过AutoDock Vina 1.1.2分析莪术醇与靶蛋白的结合能及结合模式。【结果】网络药理学分析结果显示,莪术醇抗EMCV的潜在靶点有9个,其中丝裂原活化激酶14(mitogen-activated protein kinase 14,MAPK14)、信号转导与转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)、白蛋白(albumin,ALB)、白细胞介素2(interleukin 2,IL2)可能是莪术醇抗EMCV的核心靶点,所得靶点参与C型凝集素受体信号通路、神经营养素信号通路和JAK-STAT信号通路等代谢通路,功能涉及调节炎症反应细胞因子的产生、蛋白激酶活性和药物结合等;分子对接结果显示,4种核心靶蛋白与莪术醇之间存在较强的结合能,均存在疏水形式的结合,其中ALB、STAT1和IL2与莪术醇之间还存在氢键结合。【结论】本研究结果表明,MAPK14、STAT1、ALB和IL2是莪术醇发挥抗EMCV作用的潜在靶点,本研究为莪术醇作为抗EMCV药物的研发提供理论依据和线索。

PAMs免疫粘附受体CR 1-like对PRRSV感染的影响

[目的]本试验旨在探讨猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAMs)表面天然免疫粘附受体—猪I型补体受体(Porcine complement receptor 1⁃like,CR1⁃like)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respi⁃ratory syndrome virus,PRRSV)感染PAMs的影响,为阐述CR1⁃like在PRRSV免疫应答中的生物学功能提供理论数据。[方法]采取PRRSV减毒活疫苗免疫接种PRRSV抗体为阴性的长白仔猪20~28 d后,提取分离抗病毒血清并检测抗PRRSV血清中和效价;将抗PRRSV血清进行不同倍比稀释,制备各类PRRSV抗原抗体复合物并接种于PAMs上,建立抗体依赖性增强(Antibody⁃dependent enhancement,ADE)模型,qRT⁃PCR技术检测各时间点PRRSV N基因拷贝数变化;PRRSV感染PAMs 9 h后,将抗血清和猪新鲜血清共处理细胞,运用ELISA测定不同时间点细胞上清液中猪新鲜血清C3b、C4b、CH50总活性;将PAMs分为试验组(PRRSV感染PAMs 9 h后同时加入抗血清和猪新鲜血清)和6个对照组,采用qRT⁃PCR技术检测各组不同时间点胞内和上清中PRRSV N基因的拷贝数,确定猪新鲜血清对PRRSV感染PAMs的作用;采用免疫阻断技术将PAMs分为FcR McAb阻断组、CR1⁃like McAb阻断组、共阻断组及3个对照组,qRT⁃PCR技术检测PRRSV N基因拷贝数变化,确定免疫粘附受体CR1⁃like对PRRSV感染PAMs的影响。[结果]抗PRRSV血清在PAMs上的中和抗体效价为1∶5.37;qRT⁃PCR结果成功筛选出1:20稀释度的抗PRRSV血清对病毒的复制具有促进作用;ELISA检测猪新鲜血清C3b、C4b和CH50浓度随PRRSV感染时间延长呈降低趋势;qRT⁃PCR结果显示,猪新鲜血清可以与1∶20稀释度抗PRRSV血清协同促进PRRSV的复制;qRT⁃PCR、免疫阻断技术得出1∶20稀释度抗PRRSV血清、猪新鲜血清协同促进PRRSV感染增强不只依赖于FcR,还与CR1⁃like有关。[结论]体外条件下,PAMs表面的CR1⁃like是介导PRRSV感染PAMs过程中产生ADE效应的分子之一,可与FcR协同促进PRRSV感染PAMs。

基于网络药理学研究苦参抑菌活性成分及其作用机制

本研究基于网络药理学及分子对接技术探究苦参的主要抑菌药效成分及其作用机理,为开发其为新型饲料添加剂提供理论基础。通过中药系统药理数据库与分析平台(TCMSP)预测苦参药效成分和靶点,并利用疾病数据库筛选抑菌靶点。利用Venny网站获取苦参药效靶点和抑菌靶点交集的靶点和韦恩图。利用STRING网站进行关键靶点蛋白相互作用(PPI)分析。基因本体(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析通过DAVID数据库在线分析。通过分子对接方法来确认关键药效成分与关键抑菌靶点之间的亲和力,并将对接结果作图。结果表明:经过一系列分析后,得到的苦参的药效成分、药物靶点、抑菌靶点、苦参和抑菌共同靶点分别是24、197、907、75个。PPI分析发现,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤蛋白P53(TP53)等32个蛋白可能是苦参抑菌作用的关键靶点。通过GO功能和KEGG富集分析,获得616个条目和156条通路。分子对接结果显示,度值排名前5位的活性成分(槲皮素、木犀草素、刺芒柄花素、8-异戊烯基山奈酚、菜豆素)和AKT1、TNF、TP53有较好的亲和力,AKT1、TNF、TP53可能是苦参发挥抑菌作用的主要靶点。通过分析得出,苦参主要通过槲皮素、木犀草素、刺芒柄花素等主要药效成分作用于AKT1、TNF、TP53等靶点,通过白细胞介素-17(IL-17)、TNF、C型凝集素受体等信号通路发挥抑菌作用,该研究结果表明了苦参通过多成分、多靶点、多通路实现抑菌作用。

基于溃疡性结肠炎模型探讨锦灯笼提取物的抗炎及抗氧化作用

【目的】探讨锦灯笼提取物对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用。【方法】将108只SPF级雄性昆明小鼠随机分为6组:空白对照组(CON)、模型对照组(DSS)、阳性对照组(SET)、锦灯笼提取物低(EPCF-L)、中(EPCF-M)、高剂量组(EPCF-H),每组18只。试验开始后,除CON组外的其余小鼠自由饮用3.0%DSS溶液,CON组小鼠正常饮水,不做任何特殊处理;从第8天起,SET组小鼠灌胃给予柳氮磺吡啶(100 mg/kg),EPCF-L、EPCF-M和EPCF-H组小鼠分别灌胃给予锦灯笼提取物0.25、0.5、1 g/kg,CON和DSS组小鼠以相同的方式给予蒸馏水,每日1次,每只0.2 mL,连续7 d。试验期间每日逐只称量小鼠体重,观察小鼠粪便情况,计算小鼠疾病活动指数(DAI)、结肠黏膜损伤指数(CMDI)及组织病理学变化,测定小鼠结肠组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)及炎性因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-1βmRNA表达水平。【结果】与CON组相比,DSS组小鼠体重下降明显,粪便不成型甚至出现血便,DAI评分和CMDI评分显著升高(P<0.05),结肠组织可见大量炎性细胞,肠黏膜结构被破坏,SOD、CAT、GSH-Px活性显著降低(P<0.05),IL-6和IL-1β基因mRNA表达水平显著升高(P<0.05),表明小鼠溃疡性结肠炎模型建立成功。与DSS组相比,结肠组织中炎性细胞浸润、黏膜充血和出血等情况减少,SET、EPCF-M、EPCF-H组的DAI和CMDI评分显著降低(P<0.05),SOD、CAT、GSH-Px活性显著升高(P<0.05),IL-6和IL-1β基因mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。【结论】锦灯笼提取物对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎有治疗作用,其可能途径是提高机体的抗氧化功能及减少炎性因子的产生。

苦参碱联合不同抗生素抗炎作用比较研究

旨在比较苦参碱与不同抗生素联合使用的抗炎作用。研究选取5种抗生素:阿莫西林、金霉素、盐酸多西环素、氟苯尼考和替米考星,以猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)5′UTR RNA和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)共刺激的原代猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAMs)为炎症模型,IL-1β为检测指标,筛选与苦参碱具有相似抗炎作用的抗生素,并采用qPCR和Western blot检测苦参碱与抗生素联合用药对IL-1β的影响。结果发现,5种抗生素中,阿莫西林和金霉素对IL-1βmRNA抑制效果与苦参碱相似。联合用药结果显示,苦参碱和阿莫西林之间存在交互作用,苦参碱可替代部分阿莫西林的用量,而苦参碱和金霉素之间不存在交互作用。在抗PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激诱导IL-1β表达的过程中,苦参碱和阿莫西林联合使用后,苦参碱能替代部分阿莫西林的药效,降低阿莫西林的使用量。本研究为苦参碱作为抗生素替代物的临床应用提供数据支持。

锦灯笼宿萼中甾体类化学成分与抗炎活性

目的研究锦灯笼Physalis alkekengi var.franchetii宿萼95%乙醇提取物的化学成分与抗炎活性评价。方法采用硅胶柱、Sephadex LH-20凝胶柱、HPLC制备等方法进行分离、纯化,通过波谱技术对化合物结构进行鉴定,采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW264.7小鼠单核巨噬细胞体外炎症模型进行抗炎活性评价。结果分离得到14个化合物,分别鉴定为7β-ethoxy-25,27-dihydro-3,6-didehydroisophysalin M(1)、异酸浆苦素B(2)、4,7-didehydroneophysalin B(3)、酸浆苦素B(4)、25,27-dihydro-4,7-dedehydro-7-deoxyneophysalin A(5)、酸浆苦素E(6)、酸浆苦素L(7)、酸浆苦素O(8)、酸浆苦素D(9)、ergosta-4,24(28)-diene-3-one(10)、24-ethylcholesta-4,24(28)-dien-3-one(11)、sitosterone(12)、gramisterol(13)、柠黄醇(14);在抗炎活性评价实验中,化合物2~6、8~9对NO生成具有抑制作用。结论化合物1为新化合物,命名为酸浆苦素M1;化合物10~12、14均为首次从该属植物中分离得到;此外,化合物6对NO具有显著抑制作用,半数抑制浓度(median inhibition concentration,IC50)值为15.07μmol/L,与阳性L-NMMA(IC50=36.11μmol/L)相比具有较好的抗炎活性。

博落回叶提取物对小鼠溃疡性结肠炎的影响

【目的】研究博落回叶提取物(Macleaya cordata leaf extract,MCLE)对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎(UC)小鼠的保护作用,为博落回叶的资源利用和药物开发提供理论依据。【方法】选择60只C57BL/6小鼠,随机分成6组,即对照组(CON)组、DSS模型组、美沙拉嗪(MES)阳性对照组(200 mg/kg)及MCLE高(MCLE-H,450 mg/kg)、中(MCLE-M,150 mg/kg)、低(MCLE-L,50 mg/kg)剂量组,试验期14 d。通过小鼠的一般症状、体重变化、疾病活动指数(DAI)、脾脏指数、结肠长度及组织病理学等指标评价MCLE对DSS诱导的小鼠结肠炎模型的治疗效果。使用ELISA和实时荧光定量PCR分别检测血清和结肠组织中白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达水平;比色法测定结肠组织中髓过氧化物酶(MPO)和一氧化氮(NO)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;通过分析16S rRNA基因序列确定MCLE对肠道菌群的影响;采用气相色谱法测定结肠内容物中短链脂肪酸(SCFAs)的含量。【结果】MCLE处理组均极显著抑制了UC小鼠的体重降低和结肠长度的缩短(P<0.01),并显著降低了小鼠DAI、脾脏指数及结肠组织病理学评分(P<0.05);MCLE显著下调了结肠和血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达(P<0.05),降低了结肠组织中MPO、NO和MDA的含量(P<0.05),增加了GSH-Px、SOD活性及CAT含量(P<0.05);与DSS组相比,拟杆菌属、另枝菌属、阿克曼氏菌属等有益菌属在MCLE给药组中丰度占比增加,病原菌如脱硫弧菌属等占比减少。此外,MCLE治疗还显著提高了UC小鼠肠内容物中SCFAs(乙酸、丙酸、丁酸)的水平(P<0.05)。【结论】MCLE可能是通过调节炎症因子水平、减轻氧化应激影响、维持肠道菌群稳态和恢复短链脂肪酸的产生发挥抗结肠炎作用。

黑种草子提取物对小鼠酒精性肝损伤的修复作用及机制研究

【目的】验证黑种草子提取物对小鼠酒精性肝损伤的修复作用并探究其机制,为其临床开发研究提供理论依据。【方法】将56只3周龄昆明小鼠随机均分为7组:空白对照组,模型组,黑种草子提取物高、中、低剂量组,黑种草子粉剂组及水飞蓟宾阳性对照组,每组8只。除空白对照组外,其余各组均以10 mL/kg 60%酒精灌胃,每天1次,连续15 d。第16天,黑种草子提取物高、中、低剂量组分别给予8、4、2 mL/kg黑种草子提取物,每天1次,连续10 d后处死小鼠。计算各组小鼠肝脏指数;检测血清中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活力;制备肝脏石蜡切片观察其病理变化;Western blotting检测NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1,Caspase-1)和白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)的蛋白表达水平。【结果】与空白对照组相比,模型组小鼠肝脏指数显著上升(P<0.05),肝细胞出现明显颗粒变性,水泡变性,核溶解,界限区分不清,肝索消失;血清ALT、AST活力显著上升(P<0.05),SOD、CAT、GSH-Px活力显著下降(P<0.05),说明肝损伤模型建立成功,且肝脏组织中NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组相比,黑种草子提取物各剂量组血清ALT、AST活力均呈下降趋势,SOD、CAT、GSH-Px活力均呈上升趋势,其中高剂量组上述各指标均呈显著差异(P<0.05),肝脏组织结构明显改善,NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表达水平均显著下降(P<0.05)。【结论】高剂量(8 mL/kg)黑种草子提取物可显著提高肝损伤小鼠的抗氧化水平,且可以通过抑制NLRP3炎性小体的表达而减少IL-1β的合成,从而改善肝脏功能和修复受损的肝脏组织结构。

犬乳腺上皮细胞的分离鉴定及培养方法优化

为建立一种快速分离犬原代乳腺上皮细胞的培养方案,本研究旨在从健康泌乳金毛犬的乳汁中分离原代乳腺上皮细胞,接种于两种不同的培养基后传代培养,探讨不同培养基下细胞的生物学特征,提供犬乳腺上皮细胞简单便捷的分离措施及适宜的培养方法。选取泌乳一周的金毛犬在无菌条件下收集乳汁,离心处理后得到乳腺上皮细胞,分别用完全培养基和基础培养基接种培养,经形态学对比观察,间接免疫荧光检测角蛋白8(Cytokeratin 8)表达情况,绘制两种培养基培养下的第3代乳腺上皮细胞生长曲线;探讨完全培养基培养的第6代乳腺上皮细胞的冻存复苏活力。结果表明:1)乳汁分离可得到大量细胞团块,分别接种两种培养基后都会出现“煎蛋样”贴壁细胞,消化传代后两者均有Cytokeratin 8的高度表达;2)接种于基础培养基的细胞前期以聚集在一起的圆形单克隆细胞团块为主,传至第4代仅有少量细胞存活,细胞随着培养时间增加而状态变差,死亡细胞增多;接种于完全培养基的细胞整体呈“鹅卵石铺路样”成片生长,随着传代次数增加细胞状态稳定,细胞生长曲线呈现“S”形;3)完全培养基培养的第6代乳腺上皮细胞冻存复苏后能快速贴壁并分裂增殖。综上,乳汁分离法成功分离犬乳腺上皮细胞,且与基础培养基相比,完全培养基可以更好地维持细胞活性,促进细胞增殖分裂,且不影响细胞冻存后复苏的活力,为后期快速分离犬乳腺上皮细胞提供较优的培养方案。

苦参碱抗PCV2诱导小鼠肺炎的作用及其机制研究

为探讨苦参碱在小鼠体内的抗炎作用及其机制,本研究利用猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染诱导小鼠肺炎模型,将32只昆明小鼠均分为空白对照组、PCV2组、苦参碱处理组(40mg/kg)和利巴韦林阳性对照组(40mg/kg)。除空白对照组外,其他各组小鼠每只腹腔注射0.5mL PCV2,攻毒后的第5天开始腹腔注射对应药物,每天给药一次,连续给药5d。在攻毒后的第11天,观察小鼠肺脏的病理组织学变化,qPCR检测PCV2 Cap基因,IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α基因的mRNA表达,Western blot检测相应炎症因子、TLR4/MyD88/NF-κB信号通路及NLRP3炎症小体关键蛋白的表达。结果表明:1)苦参碱可显著抑制PCV2感染诱发的肺间质增宽现象。2)苦参碱可显著降低肺脏PCV2病毒载量(P<0.05)及炎症因子IL-1β(P<0.05)、IL-6(P<0.0001)、IL-8(P<0.0001)和TNF-α(P<0.0001)的mRNA和蛋白(P<0.0001)的相对表达量。3)苦参碱可显著降低TLR4(P<0.0001)、MyD88(P<0.0001)、p-IκBα(P<0.0001)、NF-κB p65(P<0.01)、NLRP3(P<0.0001)、ASC(P<0.0001)和Caspase-1(P<0.0001)的蛋白表达量,升高IκBα(P<0.001)的蛋白表达量。综上,苦参碱可通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的活化以及NLRP3炎症小体的激活,来发挥抗PCV2诱导的小鼠肺炎作用,为进一步揭示苦参碱的抗病毒抗炎作用提供数据支撑,为苦参碱作为新兽药开发奠定基础。