DMA选择性激动心力衰竭大鼠离体心室肌细胞Na^(+)/Ca^(2+)交换体提高心肌变力

目的二甲基氨氯吡咪(DMA)作为强效的选择性Na^(+)/H^(+)交换体抑制剂,可以特异性增强大鼠心肌细胞的Na^(+)/Ca^(2+)交换(NCX)电流。NCX是治疗心力衰竭(心衰)的一个有潜力的靶点。本研究拟验证DMA是否增强NCX电流(INa/Ca),诱导Ca^(2+)内流,产生对心衰大鼠心室肌细胞的正性肌力作用。方法采用腹主动脉缩窄法诱导大鼠心衰模型,胶原酶法急性分离正常和心衰大鼠心室肌细胞;采用膜片钳全细胞记录方法测定细胞的I_(Ca-L),I_(Na),I _(K1),I_(to),和I_(Na/Ca),膜电流大小以电流强度表示,在正常和心衰大鼠离体心室肌细胞中观察DMA对主要离子电流的影响。结果DMA(0.1、0.3、1和3μmol/L)对正常和心衰大鼠心室肌细胞NCX内向和外向电流均呈浓度依赖性增加,心衰大鼠心室肌细胞在电位+50mV的外向INa/Ca密度分别增大了(10.78±4.73)%、(31.47±5.47)%、(55.60±16.84)%、(75.01±19.74)%,在电位-100mV的内向INa/Ca密度分别增大了(19.00±6.29)%、(33.51±20.17)%、(55.49±22.56)%、(94.77±15.75)%。DMA诱导的向内NCX电流的增强作用大于对外向NCX电流作用,但DMA对ICa-L、INa、I K1和Ito无明显影响。结论DMA可以双向激动心衰大鼠心肌细胞,DMA的正性肌力作用可能与INa/Ca升高相关。DMA作为一种新的NCX激动剂,为治疗心衰提供新思路。

抗乙酰基转移酶TIP60单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备并鉴定Tat相互作用蛋白60(TIP60)的单克隆抗体。方法通过生物信息学方法分析TIP60蛋白结构并预测抗原表位。根据预测结果,选择TIP60蛋白C端的11-30位氨基酸序列,合成KLH修饰的多肽作为抗原并免疫BALB/c小鼠。经过4次免疫后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合;利用间接ELISA筛选阳性克隆。通过质谱和Western blot法鉴定获得的单克隆抗体的特异性。结果筛选得到一株稳定分泌抗TIP60抗体的杂交瘤细胞株,质谱结果显示获得的抗体结合到高丰度的TIP60片段,该株抗体能识别人、大鼠和小鼠TIP60蛋白。结论本研究获得了一株识别人、大鼠和小鼠TIP60蛋白的多种属特异性单克隆抗体。

人分泌型磷脂酶A2 GIIE的E54突变及其对底物选择性的影响

人分泌型磷脂酶A2 GIIE (Human secreted phospholipase A2 GIIE,hGIIE)通过发挥酶催化作用,参与炎症反应和脂代谢过程。为了揭示hGIIE的底物选择机制,文中对hGIIE进行了定点突变,采用毕赤酵母Pichia pastoris重组表达突变体蛋白,然后通过阳离子交换和分子排阻两步法纯化蛋白,最后用等温微量热滴定仪测定酶活性。hGIIE的结构分析显示,氨基酸E54可能与GIIE的底物头基选择性有关,经过同源序列比对,拟将E54突变为丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)和赖氨酸(K)。突变体E54A、E54F和E54K在毕赤酵母组成型表达系统中实现重组表达,通过两步纯化,纯度达到90%以上。酶活性实验显示,突变体与底物1,2-二己酰卵磷脂(1,2-dihexanoyl-snglycero-3-phosphocholine,DHPC)和1,2-二己酰磷酸甘油(1,2-dihexyl phosphate glycerol,DHPG)的亲和力发生改变,其中突变体E54K与DHPG的Km值为突变前的0.39倍,亲和力明显增强;突变体E54F与DHPC的Km值为突变前的1.93倍,亲和力明显减弱。hGIIE的E54突变体蛋白与磷脂底物的亲和力发生明显改变,说明E54在hGIIE的磷脂底物选择性水解过程中起重要作用。