lncRNA AL022344.4促进肺腺癌细胞侵袭及迁移的初步研究

目的:研究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)AL022344.4对人肺腺癌细胞H157和A549侵袭及迁移的影响。方法:选取TCGA_LUAD和GTEx_LUNG两个公共数据库中公开数据集对lncRNA AL022344.4表达数据进行生物信息学分析;qRT-PCR检测人正常支气管上皮细胞HBEC及肺腺癌细胞(H157、A549、H1299、H1975、CALU-3)中AL022344.4的相对表达量。慢病毒感染及质粒转染构建AL022344.4敲低H157细胞及过表达AL022344.4的A549细胞,qRT-PCR检测AL022344.4在两种细胞系中的表达;采用细胞划痕实验和Transwell实验检测AL022344.4敲低及过表达对肺腺癌细胞迁移、侵袭能力的影响;采用蛋白印迹法检测E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、α-SMA、MMP9和ZEB1蛋白质表达水平。结果:生物信息学分析发现lncRNA AL022344.4在肺腺癌中较匹配的癌旁组织表达更高,qRT-PCR表明其在肺腺癌细胞中的表达亦高于正常支气管上皮细胞,差异有统计学意义(P<0.01);qRT-PCR表明AL022344.4敲低H157细胞系及过表达A549细胞系构建成功;细胞划痕和Transwell实验显示过表达AL022344.4促进A549细胞的迁移和侵袭,敲低AL022344.4抑制H157细胞迁移和侵袭;蛋白印迹法结果显示,过表达AL022344.4促进N-Cadherin、α-SMA、Vimentin、MMP9和ZEB1表达,降低E-Cadherin表达;敲低AL022344.4促进E-Cadherin表达,降低N-Cadherin、Vimentin、α-SMA、MMP9和ZEB1表达。结论:lncRNA AL022344.4通过促进ZEB1表达调控E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和α-SMA,协同MMP9共同促进肺腺癌细胞的侵袭和迁移。

突触融合蛋白17改善Aβ31-35诱导的小鼠海马神经细胞死亡

目的探究突触融合蛋白17(syntaxin17,STX17)在Aβ诱导的小鼠海马神经细胞死亡中的作用。方法基于WGCNA方法选取与阿尔茨海默病显著相关的基因,与自噬基因库和SNARE家族基因取交集筛选关键基因;C57BL/6小鼠海马组织中注射浓度为1 g/L的Aβ31-35和使用终浓度为5μmol/L Aβ31-35处理HT22海马神经细胞,采用Western Blot检测STX17、LC3Ⅱ、P62的蛋白表达情况;CCK-8法检测Aβ31-35处理的HT22海马神经细胞存活率;慢病毒介导HT22海马神经细胞STX17过表达后,Western blot检测Aβ31-35处理后LC3Ⅱ、P62的蛋白表达情况。结果与阿尔茨海默病显著相关的Salmon和Black模块分别与自噬基因库和SNARE亚家族取交集获取关键基因STX17。与对照组比较,经Aβ31-35处理后,HT22细胞细胞存活率[(81.81±11.65)%]明显下降(P<0.05),小鼠海马组织和HT22细胞中STX17蛋白表达均显著降低(P<0.05),LC3Ⅱ和P62蛋白表达均显著升高(P<0.05);慢病毒介导HT22海马神经细胞STX17过表达后,显著逆转Aβ31-35诱导的LC3Ⅱ、P62的蛋白表达上调(P<0.05),并改善Aβ31-35诱导的HT22海马神经细胞存活率下降[(101.91±13.81)%vs(79.21±8.75)%,P<0.05]。结论STX17通过促进自噬来改善Aβ诱导的小鼠海马神经细胞死亡。

自噬标志物LC3的节律表达破坏参与β_(1)-AA诱导的H9c2大鼠心肌细胞死亡

目的:探讨β_(1)-肾上腺素受体(β_(1)-AR)自身抗体(β_(1)-AA)对大鼠心肌细胞自噬标志物微管相关蛋白1轻链3(LC3)节律表达的影响及其在心肌细胞死亡中的作用。方法:实验材料为Sprague-Dawley(SD)大鼠和H9c2大鼠心肌细胞。将SD大鼠随机分为免疫组(β_(1)-AR组)和对照(control)组,每组6只;将H9c2细胞随机分为control组、β_(1)-AA组、慢病毒(LV)-NC组和LV-shPer2组(n=6);合成β_(1)-AR细胞外第二环抗原肽段,用于主动免疫大鼠,并使用亲和层析法从大鼠血清中提纯β_(1)-AA;β_(1)-AA处理H9c2细胞24 h后使用CCK-8法检测细胞活力;用地塞米松同步化细胞后,再给予β_(1)-AA处理,采用real-time PCR及Western blot法检测LC3的表达情况,采用Western blot法检测生物钟蛋白Per2的表达情况,使用JTK_CYCLE算法分析昼夜节律参数;用LV-shPer2感染H9c2细胞以破坏LC3的节律表达,进而采用CCK-8法检测细胞活力。结果:β_(1)-AR组大鼠血清中β_(1)-AA的A值与control组相比显著升高(P<0.05)。β_(1)-AA组H9c2细胞的活力显著低于control组(P<0.05)。β_(1)-AA可破坏H9c2细胞LC3和Per2的节律表达(JTK_CYCLE P<0.05)。通过LV-shPer2干扰Per2基因而破坏H9c2细胞LC3节律表达(JTK_CYCLE P<0.05)后,细胞活力显著降低(P<0.05)。结论:β_(1)-AA破坏H9c2大鼠心肌细胞自噬标志物LC3的节律表达,从而促进细胞死亡。

Per2蛋白抑制β_(1)-肾上腺素受体自身抗体诱导的心肌细胞死亡

目的探讨周期蛋白2(period 2,Per2)在β_(1)-肾上腺素受体(β_(1)-adrenergic receptor,β_(1)-AR)自身抗体(β_(1)-adrenergic receptor autoantibodies,β_(1)-AA)诱导的心肌细胞死亡中的作用。方法选取6~8周龄SD雄性大鼠16只随机分为主动免疫组[模型组,采用β_(1)-肾上腺素受体细胞外第二环抗原肽段(β_(1)-AR-ECⅡ)对大鼠进行主动免疫]和对照组(同期注射Na_(2)CO_(3)等溶液),每组8只。8周时取大鼠血清,提纯β_(1)-AA。购买H9c2心肌细胞,随机分为Control组、β_(1)-AA组和β_(1)-AR+β_(1)-AA组,CCK-8法检测细胞存活率(n=8);Control组和β_(1)-AA(1μmol/L)组细胞经地塞米松同步化4 h后,Western blot检测两组不同时间点心肌细胞Per2的表达,JTK_CYCLE分析昼夜节律参数(n=11);分别采用慢病毒shPer2和Per2敲低或过表达心肌细胞中Per2的表达,RT-PCR和Western blot检测Per2的表达(n=6);在慢病毒敲低Per2(n=8)和过表达Per2(n=10)基础上,结合β_(1)-AA处理,CCK-8法检测心肌细胞存活率。结果CCK-8结果显示,β_(1)-AA诱导H9c2细胞存活率明显降低(P<0.05)。Western blot结果显示β_(1)-AA显著抑制心肌细胞Per2蛋白的节律性表达(JTK_CYCLE P>0.05),其中CT8和CT16降低最为明显(P<0.01)。慢病毒敲低Per2表达可引起心肌细胞存活率降低;在此基础上进行β_(1)-AA处理,细胞存活率进一步降低(P<0.001)。而过表达Per2可明显逆转β_(1)-AA诱导的心肌细胞存活率下降(P<0.001)。结论Per2抑制β_(1)-AA诱导的H9c2心肌细胞死亡。