阿尔茨海默病发病机制相关基因生物信息学分析及实验验证

背景:阿尔茨海默病的机制挖掘十分重要,通过生物信息学对阿尔茨海默病潜在治疗靶点的研究,可以为阿尔茨海默病治疗提供良好的指示作用。目的:使用生物信息学分析方法筛选与阿尔茨海默病发病机制相关的基因并在动物水平加以实验验证。方法:利用GEO在线数据库筛选差异基因;利用DAVID在线数据库进行GO/KEGG富集分析;使用STRING数据库进行蛋白互作网络的构建;使用HPA数据库判断目的蛋白在人体中的分布情况;最后使用免疫荧光技术和免疫印迹技术验证分析蛋白表达情况。结果与结论:①利用GEO在线数据库内数据集GSE48350获取阿尔茨海默病与健康人群的基因芯片,使用GEO2R在线分析平台分析两个人群的差异基因,其中上调基因42个,下调基因131个;②GO基因功能注释分析结果显示差异基因主要位于突触前、运输囊泡和胞外囊泡;介导神经递质释放和突触小泡功能等生物进程;参与磷脂结合、受体-配体活性和网格蛋白结合等分子功能的构成;③KEGG通路分析结果显示差异基因主要富集于神经活性配体-受体相互作用、γ-氨基丁酸神经突触与逆行内源性大麻素信号等突触功能相关信号通路;④结合蛋白互作网络筛选出5个上调关键基因:CLU、GFAP、CD44、FOS、ANXA1;5个下调关键基因:GABRG2、SYT1、SYN2、KCNC1、SLC32A1;⑤实验证实在阿尔茨海默病小鼠模型的海马组织中GABRG2、KCNC1、SLC32A1表达显著下调;⑥结果提示上述3个基因可以作为治疗和诊断阿尔茨海默病的潜在基因,为阿尔茨海默病的治疗提供重要的线索,亦可以作为阿尔茨海默病与癫痫的共治疗靶点。

胰高血糖素样肽1受体激动剂治疗阿尔茨海默病的潜在靶点预测及验证

背景:阿尔茨海默病的机制探究过程中揭示了生物信息学对共同靶点筛选的重要作用,能够利用其筛选结果为基础,探究药物对该疾病的治疗效果。目的:采用生物信息学与分子生物学等方法预测胰高血糖素样肽1受体激动剂利拉鲁肽治疗阿尔茨海默病的作用靶点。方法:利用DisGeNET数据库及SEA数据库获取阿尔茨海默病和利拉鲁肽作用的共同基因;利用DAVID在线数据库对共同靶点进行GO/KEGG富集分析;使用STRING数据库构建蛋白互作网络;使用CCK-8判断利拉鲁肽的最佳使用剂量;使用免疫荧光和免疫印迹技术对关键蛋白的表达情况进行分析。采用小鼠海马神经元HT22细胞系进行体外实验,细胞被随机分为3组:HT22组、HT22+Aβ组和HT22+Aβ+Lir组。HT22组不做特殊处理,HT22+Aβ组使用Aβ1-42干预HT22细胞系24 h构建Aβ损伤细胞模型,HT22+Aβ+Lir组在HT22+Aβ组的基础上添加利拉鲁肽12 h。结果与结论:①从DisGeNET数据库筛选出阿尔茨海默病相关联的基因,共得到3333个关联基因。再从SEA数据库中,得到利拉鲁肽的潜在作用靶点147个。最后使用R包筛选出阿尔茨海默病与利拉鲁肽共同靶点64个。②用DAVID数据库进行共同靶点的GO/KEGG分析,结果提示共同靶点主要富集在:神经活性配体-受体相互作用、肾素-血管紧张素系统、膀胱癌、内肽酶活性、肽受体活性、G蛋白偶联肽受体活性和转运囊泡等生物进程。③将已经得到的64个共同靶点蛋白导入至SRTING在线数据库进行蛋白互作网络构建,得到排名前3位的基因为基质金属蛋白酶2,9和白细胞介素1β。④采用CCK-8试剂盒检测了培养细胞的活性,确定利拉鲁肽拮抗Aβ1-42的最佳浓度为100 nmol/L。⑤在免疫印迹实验与免疫荧光实验中,较HT22组相比,在HT22+Aβ组内基质金属蛋白酶2,9和白细胞介素1β表达量明显上升(P<0.05);HT22+Aβ+Lir组较HT22+Aβ组相比基质金属蛋白酶2,9和白细胞介素1β的表达量显著下降(P<0.05)。⑥结合上述生物信息学数据及在GEO数据库的差异基因二次验证结果提示,基质金属蛋白酶2,9和白细胞介素1β均可作为利拉鲁肽治疗阿尔茨海默病的潜在作用靶点。

索马鲁肽治疗阿尔茨海默病的潜在靶点:沉默信息调节因子1

背景:研究发现胰高血糖素样肽1及其类似物具有显著的神经保护作用,并且已有部分药物应用到阿尔茨海默病临床三期研究阶段,然而其发挥神经保护作用的具体机制尚不明确,有待进一步探讨阐明。目的:拟通过生物信息学和网络药理学分析方法筛选出阿尔茨海默病发病机制的相关基因,以及索马鲁肽(一种胰高血糖素样肽1受体激动剂)治疗阿尔茨海默病的相关靶点,对两者进行综合分析挑选出潜在靶点基因,并在细胞水平加以验证。方法:利用DisGeNET数据库筛选出阿尔茨海默病患者与健康人群的差异基因,利用PubChem在线数据库得到索马鲁肽的化学结构式和2D结构图,利用DAVID在线数据库进行GO/KEGG富集分析,利用STRING数据库进行蛋白互作网络的构建,利用HPA数据库判断目的蛋白在人体各组织中的分布特点,最后使用蛋白印迹技术和免疫荧光技术检测索马鲁肽干预HT22细胞之后的蛋白表达情况。结果与结论:①利用DisGeNET数据库内数据得到3374个阿尔茨海默病患者与健康人群的差异基因,同时获得索马鲁肽潜在药物的101个靶基因,取两者交集得到23个相关基因;结合蛋白互作网络从中筛选出10个关键基因,分别是沉默信息调节因子1(SIRT1)、CASP9、CCND1、CASP1、KEAP1、DLG4、CASP4、GRB2、GRIA1、EDNRA;②GO基因功能分析显示关键基因主要富集在:半胱氨酸型内肽酶的正向调节活动,蛋白溶解的正向调节,半胱氨酸型内肽酶的正向调节,涉及凋亡活动过程的细胞质部分,AMPA谷氨酸受体复合物,炎症复合物,CARD结构域结合,半胱氨酸型内肽酶活性,半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡过程;KEGG信号通路分析结果主要为:结直肠癌,非小细胞癌,子宫内膜癌,上述均与免疫浸润、炎症、自噬凋亡相关;此外,根据关键基因的关联度排名及在HPA在线数据库不同组织中的分布情况,挑选出最显著的差异基因为SIRT1;③细胞实验显示,SIRT1蛋白表达在β-淀粉样蛋白1-42干预后的HT22细胞中显著下调,而经过索马鲁肽处理后明显上升;④结果显示,SIRT1可能是索马鲁肽治疗阿尔茨海默病的靶点基因。

阿魏酸治疗阿尔茨海默病的潜在靶点预测及验证

目的利用生物信息学和分子生物学对阿魏酸在阿尔茨海默病(AD)治疗中的靶点进行预测,并研究其在AD中的疗效。方法通过DisGeNET数据库和PubChem数据库获得AD与阿魏酸相互作用的共同基因;DAVID在线数据库对常见靶点进行GO/KEGG富集分析;利用STRING数据库建立蛋白互作网络筛选关键基因;通过免疫印迹和酶联免疫吸附试验,对得到的关键基因的表达进行分析。结果在确定了38个共同作用靶点后,通过蛋白互作网络的构建确定了前3名的基因,分别是基质金属蛋白酶9(MMP9)、Toll样受体4(TLR4)和血管紧张素转化酶(ACE)。在免疫印迹和酶联免疫吸附试验中,阿魏酸下调MMP9、TLR4和ACE的表达(P<0.05)。结论MMP9、TLR4和ACE可作为阿魏酸治疗AD的潜在作用靶点。

人LAPTM4B新基因多态性与淋巴瘤易感性的关系

目的探讨人新基因溶酶体相关4次跨膜蛋白质B(lysosome-associated protein transmembrane 4 beta,LAPTM4B)多态性与淋巴瘤易感性的关系。方法以病例-对照研究的方法,基于特异性引物的PCR对350例正常人和166例胃癌患者进行LAPTM4B基因分型,用χ2检验检测淋巴瘤组和对照组基因型频率和其他参数的分布。结果淋巴瘤组中LAPTM4B基因的*2等位基因的频率为34.94%,较对照组(24.14%)显著增高(P<0.001)。基因型分布在淋巴瘤组与对照组间差异有统计学意义。*1/2和*2/2基因携带者患淋巴瘤的危险性分别是*1/1的1.475倍(95%CI:0.994-2.189)与3.532倍(95%CI:1.802-6.923)。*2等位基因携带者患淋巴瘤的危险性是*1等位基因的1.710倍(95%CI:1.287-2.271)。LAPTM4B基因型分布与患者年龄、性别、病理类型、临床分期、HBV感染、乳酸脱氢酶(LDH)、β2-微球蛋白(β2-MG)以及有无全身症状等参数无明显关系。结论LAPTM4B基因多态性与淋巴瘤易感性相关,*2等位基因可能是淋巴瘤发生的危险因素。

酵母双杂交系统3筛选人源核不均一核糖核蛋白E1的功能伙伴

背景:酵母双杂交系统3是目前最常用的筛选相互作用蛋白质的技术平台。目的:运用酵母双杂交系统3筛选人源核不均一核糖核蛋白E1的相互作用子。方法:构建酵母细胞表达载体hnRNPE1-pGBKT7/c-myc,转化酵母菌AH109,Western blot证实蛋白表达,进行毒性和自激活检验,与转化了cDNA文库的酵母菌Y187接合,经过营养删除、滤膜反应以及回交试验筛选酵母文库中与hnRNP E1相互作用的蛋白。结果与结论:hnRNP E1蛋白能在酵母中正常表达,对酵母细胞无毒性,不存在自激活现象。经缺陷培养基3次传代及滤膜反应初步筛选出了16个候选基因,再经NCBI基因比对(BLASTN和BLASTP)及酵母细胞中的免疫沉淀反应最终获得了8个候选蛋白。提示hnRNP E1可能参与特定细胞内的复制,转录,mRNA运输、细胞周期、细胞自噬及免疫应答的过程,并且可能参与某些遗传病的发病过程。

正常乳腺及乳腺癌中Fas的表达及意义

乳腺癌的发生发展过程中，细胞凋亡的异常是其中一个重要原因．细胞凋亡因子Fas包含有细胞膜上Fas（mFas）及可溶性（sFas）形式，mFas可介导正常人体细胞凋亡，而肿瘤细胞通过抑制细胞凋亡得以逃脱免疫监控，成为肿瘤发生和发展的一个途径，sFas在其中起到一定作用。我们通过检测血清sFas的水平，探讨sFas在乳腺癌中的意义：对mFas的表达进行了检测与比较分析．以期有利于对乳腺癌认识的深化。并为将来治疗方案的制订提供理论依据。

吕梁地区泌尿生殖道解脲脲原体感染状况及药敏分析

解脲脲原体（Uu）菌落微小,直径仅有15~25μm,可引起泌尿生殖道感染,并被认为是非淋球菌性尿道炎中仅次于衣原体的重要病原体[1]。研究发现Uu传染性强,感染患者常反复感染,症状反复,难以彻底治愈,是引起泌尿生殖道支原体感染的主要致病类型[2]。Uu多寄生在男性尿道、阴茎包皮和女性阴道,

结核分枝杆菌抗体检测蛋白芯片的制备及应用

目的:用重组结核分枝杆菌ESAT6、CFP10、M16和M38抗原制备相应的抗体检测蛋白芯片。方法:将制备的结核分枝杆菌抗原ESAT6、CFP10、M16和M38及购买的LAM抗原点于醛基化修饰的玻片上,制备成结核抗体检测蛋白芯片;使用该芯片对130例临床结核病患者和50例健康体检者血液样品进行检测,分析其敏感性和特异性,以及5项结核抗体的构成比。结果:结核杆菌抗体检测蛋白芯片的敏感性为90.8%(118/130),特异性为90%(45/50),LAM的检出率最高为91.5%。结论:用ESAT6、CFP10、M16和M38及LAM抗原制备的结核杆菌抗体检测蛋白芯片用于结核病辅助诊断的敏感性和特异性较高,可用于结核分枝杆菌抗体检测蛋白芯片试剂盒的开发。

HLA-DRB1基因与IgA肾病关联性的研究

目的:探讨HLA-DRB1等位基因与山西汉族IgA肾病的关联性。方法:用聚合酶链反应序列特异性探针(PCR-SSO)法,对30例IgA肾病患者和45例正常对照者进行了HLA-DRB1等位基因分型。结果:IgA肾病组的HLA-DRB1*15基因频率明显较正常对照低(5.00%vs 17.78%,P=0.021,OR=0.243,95%CI:0.068,0.876),IgA肾病组的HLA-DRB1*04基因频率明显较正常对照高(30.00%vs 15.56%,P=0.034,OR=2.327,95%CI:1.052,5.145)。结论:HLA-DRB1*15可能与山西IgA肾病的抵抗性有关,HLA-DRB1*04可能与山西IgA肾病的易感性有关。

凋亡抑制因子Survivin在大肠杆菌TB1中的表达纯化及鉴定

本文旨在克隆凋亡抑制因子Survivin基因,并在大肠杆菌中进行可溶性表达与初步纯化.采用RT-PCR法,扩增人凋亡抑制因子survivincDNA,并克隆入原核表达载体pMAL-p2X中,转化TB1大肠杆菌感受态细胞.经0.3mmol/LIPTG诱导2h后,收集菌体蛋白,进行SDS-PAGE、ELISA及Western印迹鉴定.实验获得凋亡抑制因子survivin编码区cDNA,以构建的原核表达载体pMAL-p2X-survivin转化菌株后,可表达凋亡抑制因子survivin和麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白,相对分子质量(Mr)为58000.并成功利用FactorXa将融合蛋白裂解开.ELISA和Western印迹表明,融合蛋白能与抗凋亡抑制因子survivin单克隆抗体特异性结合.获得的凋亡抑制因子survivin全长cDNA可在大肠杆菌TB1中以MBP-survivin融合蛋白的形式表达,成功地将survivin目的蛋白和MBP蛋白分离,为深入研究survivin的结构和功能奠定了基础.

干燥综合征患者外周血NLR和PLR与疾病活动度的相关性分析

目的探讨干燥综合征(SS)患者中性粒细胞/淋巴细胞比值(NLR)和血小板/淋巴细胞比值(PLR)与疾病活动度的相关性。方法收集81例SS患者临床资料和实验室数据,以30名健康体检者为健康对照组。根据SS疾病活动指数(ESSDAI)将SS患者分为活动组和缓解组,比较各组NLR、PLR的差异,分析NLR、PLR与ESSDAI、C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)等指标的相关性。结果SS组NLR和PLR显著高于健康对照组(P<0.01),活动组NLR和PLR显著高于缓解组(P<0.01)。SS患者NLR、PLR与ESSDAI评分均呈正相关(r值分别为0.860、0.642,P<0.01)。受试者工作特征(ROC)曲线分析结果显示,NLR、PLR判断SS疾病活动的曲线下面积分别为0.770、0.675,最佳临界值分别为3.18、170.14,敏感性分列为68.6%和57.1%、特异性分别为73.9%和71.7%。结论NLR、PLR与SS疾病活动度有关,NLR比PLR能更准确地评估SS患者的疾病活动情况。

鲍曼不动杆菌在不同年龄感染人群中的耐药率差异

鲍曼不动杆菌（acinetobacter baumannii,Ab）为革兰阴性非发酵杆菌。Ab对湿热、紫外线、消毒剂有较强的抵抗力,可广泛存在于自然界的水、土壤、医院环境中,同时也存在于人体皮肤、呼吸道和消化道等中,当机体免疫力低下或缺陷时易引起呼吸道感染、泌尿系感染、伤口感染和败血症等。

雷帕霉素调控丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白复合物通路对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨雷帕霉素对RA滑膜成纤维细胞(RA-FLS)增殖、凋亡的影响及作用机制。方法收集关节置换术中获得的RA患者滑膜组织,用胰酶消化法提取原代FLS。利用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测雷帕霉素对RA-FLS增殖的影响,将RA-FLS分为对照组、雷帕霉素组(10 nmol/L)。流式细胞术检测雷帕霉素对RA-FLS细胞凋亡的影响。实时荧光定量(RT)-PCR法检测雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2相关X基因(Bax)、Bcl-2 mRNA表达水平。蛋白印迹法检测Bax、Bcl-2、mTOR、磷酸化(p)-mTOR(2448)、AKT、p-AKT及mTOR复合物1(mTORC1)下游相关分子S6激酶1(S6K1)、p-S6K1、真核翻译启动因子-4E结合蛋白1(4EBP1)、p-4EBP1的蛋白表达水平。2组间差异比较采用两独立样本t检验。结果雷帕霉素干预的RA-FLS的增殖效率明显弱于对照组,且雷帕霉素的药物抑制率随着雷帕霉素浓度的升高而升高;雷帕霉素组的细胞凋亡率较对照组升高[(5.31±0.59)%与(3.49±0.40)%,t=7.83,P=0.001];与对照组相比,雷帕霉素组Bax mRNA表达明显升高(1.35±0.04与1.00±0.00),t=15.60,P=0.004,Bcl-2 mRNA(0.790±0.003与1.000±0.000,t=85.50,P=0.007)、mTOR mRNA(0.41±0.08与1.00±0.00,t=14.37,P=0.044)、AKT mRNA(0.59±0.08与1.00±0.00,t=7.54,P=0.017)表达降低,差异均有统计学意义;与对照组相比,雷帕霉素组Bax蛋白表达明显升高(0.75±0.10与0.48±0.09,t=4.04,P=0.007),Bcl-2(0.632±0.055与0.758±0.020,t=7.35,P=0.002)、p-AKT/AKT(0.61±0.07与0.88±0.04,t=5.61,P=0.005)、p-mTOR/mTOR(0.92±0.12与1.28±0.09,t=5.05,P=0.002)、p-S6K1/S6K1(0.884±0.020与1.023±0.058,t=4.52,P=0.004)、p-4EBP1/4EBP1(0.86±0.05与1.11±0.05,t=6.00,P=0.004)蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义。结论雷帕霉素可能通过抑制AKT/mTORC1通路抑制RA-FLS细胞增殖并诱导其凋亡。

Fas、FasL及C—erbB-2在乳腺癌中的表达及其临床意义

目的探讨Fas、FasL及C—erbB-2在乳腺癌中表达及临床意义与预后的相关性。方法利用免疫组织化学法检测乳腺病变组织中mFas和mFasL表达及乳腺癌组织中C—erbB-2基因蛋白表达，ELISA法检测sFas含量。结果mFas在乳腺癌表达最低，其次是乳腺导管增生和乳腺纤维腺瘤，在正常乳腺组织中表达最高。mFasL在不同乳腺组织中表达相反。sFas在乳腺癌表达最高，其次是乳腺导管增生和乳腺纤维腺瘤，在正常乳腺组织中表达最低。mFas与C—erbB-2两者呈负相关。结论mFas、mFasL的异常表达可能与乳腺癌的发生、发展有关。sFas在乳腺癌患者血清中高表达，并与乳腺癌的肿瘤病理学分期、肿瘤大小及转移情况相关。sFas检测无明显创伤，易检测，有可能作为乳腺癌病情判断、临床分期、是否转移和疗效评价的参考指标。mFas在乳腺肿瘤组织的低表达，也可用于肿瘤预后的估计，但有待进一步研究。

原发性干燥综合征患者感染相关因素的研究

目的总结原发性干燥综合征患者(pSS)感染的特点及相关影响因素。方法收集340例pSS患者的临床资料和实验室数据,根据是否感染分为感染组与未感染组。对患者在感染部位、合并间质性肺炎、血常规、清蛋白(ALB)、免疫球蛋白、外周血淋巴细胞亚群进行分组分析。结果pSS患者合并感染的发生率为39.1%,呼吸系统感染居首位,pSS合并间质性肺炎患者更易发生感染。与未感染组比较,感染组红细胞(RBC)、血红蛋白(HB)、ALB、免疫球蛋白(Ig)A、CD3^(^(+))T、CD4^(+)T、CD8^(+)T细胞、B细胞降低,中性粒细胞绝对值(NEU)、红细胞沉降率(ESR)及C反应蛋白(CRP)升高,差异有统计学意义(P<0.05)。感染程度与RBC、HB、ALB、CD3^(+)T、CD4^(+)T、CD8^(+)T细胞、B细胞及IgA水平呈负相关(P<0.05)。结论pSS患者HB、ALB、IgA及外周血淋巴细胞亚群水平对患者感染情况有重要意义。

急性呼吸道感染患儿中检出B1基因亚型人偏肺病毒

目的初步了解急性呼吸道感染（acute respiratory infection, ARI）住院儿童中人偏肺病毒（human metapneumovirus, HMPV）感染情况。方法于2017年1月1日至12月31日在山西省儿童医院呼吸科采集居住在太原市的、年龄1～5岁的ARI儿童鼻咽洗液标本，通过逆转录-聚合酶链式扩增技术（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）检测HMPV核蛋白（nucleoprotein, N）基因，对扩增得到的阳性PCR产物进行序列测定、同源性比较和系统进化分析。结果于2017年2月份、11月份采集的标本中分别检测到1份、2份HMPV阳性标本。PCR产物核酸和推导氨基酸序列与GenBank中已有HMPV相应核酸和推导氨基酸序列同源性分别高于83%、90%。系统进化分析显示检测到的HMPV为B1基因亚型HMPV。结论太原市儿童ARI中流行的HMPV主要是B1基因亚型。