HIF-1α稳定表达抑制缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡的作用研究

目的探讨低氧诱导因子-1α（HIF-1α）稳定表达对大鼠心肌缺血再灌注细胞凋亡的影响及可能机制。方法采用结扎冠脉左前降支45min，再灌注3h的方法，构建大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。实验分为假手术组（Sham）、心肌缺血／再灌注组（MI／R）、HIF-1α活化剂DMOG＋心肌缺血／再灌注组（D＋MI／R）、HIF-1α抑制剂YC-1＋心肌缺血，再灌注组（YC-1＋MI／R），采用全自动生化分析仪测定血清心肌酶（CK—MB，LDH）活性，Western blot检测心脏组织HIF-1α蛋白表达，Evens blue／Trc染色测定心肌梗死面积，TUNEL染色及Caspase-3、8、9活性测定心肌细胞凋亡。结果①与MI／R组相比，D＋MI／R组的HIF-1α蛋白表达量增加约4．6倍（P〈0．01），心肌酶CK—MB、LDH的活性降低（P〈0．05），心肌梗死面积减小（P〈0．05），并且心肌组织的病理损伤减轻。②D＋MI／R组心肌细胞凋亡率为（9．7±0．98）％，明显低于MI／R组的（23．5±1．5）％（P〈0．05），且部分逆转了缺血再灌注后心肌组织Caspase-9和Caspase-3的活性升高（P〈0．05）。结论HIF-1α稳定表达可抑制线粒体途径介导的心肌细胞凋亡，从而发挥对缺血再灌注损伤的心脏保护效应。

自噬下降对β1受体自身抗体诱导的H9c2心肌细胞凋亡的作用

目的探讨自噬下降对β1肾上腺素受体自身抗体（β1-AA）诱导的H9c2心肌细胞凋亡的作用。方法使用1μM的β1-AA对H9c2心肌细胞进行处理，Realtime—PCR检测自噬相关基因LC3mRNA表达的改变，Westernblot检测LC3、Beclin1以及P62蛋白表达水平的变化；使用流式细胞术、Caspase-3活性检测及Hoechst33258染色反映细胞凋亡情况；使用经典的自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）预处理30min，以及mTOR通路抑制剂雷帕霉素（RAPA）预处理1h后，再给予细胞β1-AA处理，检测此时细胞凋亡的变化情况。结果与对照组相比，1μM的β1-AA干预H9c2心肌细胞6h可以明显降低细胞存活率[（83．46±12．87）％比（96．45±6．99）％]。与对照组（1．01±0．14）相比，β1-AA干预细胞6h、12h、24h，LC3 mRNA水平依次降低[6h（0．85±0．11），12h（0．71±0．10），24h（0．62±0．07）]，LC3Ⅱ和Beclin 1蛋白水平依次降低，P62蛋白水平逐渐增加，表明β1-AA可以引起心肌细胞自噬水平逐渐下降。同时发现，与对照组（1．13±0．24）相比，β1-AA干预细胞6h、12h，细胞凋亡水平明显升高，分别达到3．21±0．89和2．14±0．24。使用经典自噬抑制剂3-MA预处理心肌细胞30min抑制自噬后，H9c2心肌细胞凋亡水平较β1-AA单独处理组显著增加[（41．45±6．37）％比（29．55±4．32）％]；而使用经典mTOR通路抑制剂RAPA预处理心肌细胞1h上调自噬后，心肌细胞凋亡水平较β1-AA单独处理组明显下降[（17．36±2．98）％比（29．55±4．32）％]，说明自噬水平改变可以影响心肌细胞凋亡水平。结论自噬下调能够增加β1-AA诱导的H9e2心肌细胞凋亡。

橙皮素对H2O2诱导H9c2心肌细胞凋亡的抑制效应研究

目的 探讨橙皮素（HES）对H2O2诱导的H9c2心肌细胞凋亡的影响.方法 采用H2O2建立H9c2心肌细胞氧化应激损伤模型.实验分为4组：正常对照组（Control组）、H2O2损伤组（H2O2组）、单纯橙皮素处理组（HES组）、橙皮素预处理＋H2O2组（HES＋H2O2组）.H2O2（400μM）处理2 h建立心肌细胞氧化应激损伤模型,HES＋H2O2组于建模前1 h加入40μM橙皮素.采用CCK-8法确定H9c2细胞活性,DCFH-DA探针检测细胞活性氧簇（ROS）水平,流式细胞术检测心肌细胞凋亡,分光光度计检测Caspase-3活性.结果橙皮素预处理可明显改善H2O2诱导的H9c2心肌细胞活性降低,且浓度为40μM时保护作用最明显;给予40μM橙皮素预处理后ROS的产生明显减少,Caspase-3活性显著下降,心肌细胞凋亡率为（28.32±2.12）%,明显低于H2O2组（50.33±2.56）%（P〈0.05）.结论 橙皮素对氧化应激诱导的心肌细胞凋亡具有抑制效应.

HIF-1α抗心肌缺血再灌注炎性损伤的作用

目的:本文旨在通过稳定低氧诱导因子1α(HIF-1α)表达,探讨其在大鼠心肌缺血再灌注(I/R)所致炎性损伤中的作用及可能的机制。方法:60只清洁级雄性Wistar大鼠随机分为4组:假手术(sham)组、I/R组、HIF-1α稳定剂二甲基乙二酰甘氨酸(DMOG)+I/R组和HIF-1α抑制剂YC-1+I/R组。各组分别予相应处理后,用Western blot法检测心肌组织的Toll样受体4(TLR4)和核因子κB(NF-κB)的蛋白表达;real-time PCR检测白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、TLR4和NF-κB的mRNA水平;并利用试剂盒检测心肌组织的髓过氧化物酶(MPO)活性;HE染色观察炎性细胞浸润情况。结果:HIF-1α可明显降低心肌组织中炎性细胞的浸润、MPO活性及炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平,同时降低TLR4和NF-κB的mRNA及蛋白水平(P<0.05)。结论:HIF-1α可减轻心肌I/R引起的炎性损伤,其机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路激活有关。

DMOG稳定缺血/再灌注心肌组织低氧诱导因子-1α表达时间规律的研究

目的 观察二甲氧乙二酰甘氨酸（DMOG）预处理对大鼠缺血再灌注（I/R）心肌组织中低氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达的影响,探讨DMOG稳定HIF-1α表达的时间规律.方法 雄性Wistar大鼠随机分为假手术组（Sham组）、心肌缺血再灌注组（MI/R组）、DMOG＋MI/R组、YC-1＋MI/R组（YC-1为HIF-1α抑制剂）.建立心肌缺血/再灌注模型,心肌缺血45 min,再灌注0h、3h、6h、9h四个时间点.留取心脏左室前壁标本,分别采用Western blot和Real-time PCR法检测心肌组织中HIF-1α蛋白与mRNA表达水平.结果 ①再灌注相同时间点,D＋MI/R组的HIF-1α蛋白表达量均明显高于MI/R组;在观察时间内,D＋MI/R组的HIF-1α蛋白表达量呈现出先增高、后降低的趋势,并且在再灌注3h时达峰值（P＜0.05）.②HIF-1α的mRNA表达量在不同组间及再灌注各个时间点均无明显差异（P＞0.05）.结论 DMOG预处理能够稳定心肌I/R时HIF-1α的蛋白表达量,峰值出现于再灌注3h,而对HIF-1α的mRNA表达量无明显影响,表明这种作用主要发生于蛋白合成过程,而非基因转录水平.