负载人脐带间充质干细胞的水凝胶对糖尿病小鼠皮肤创面愈合的疗效

背景:目前,缺乏有效的治疗方法促进糖尿病患者的皮肤创面愈合。人脐带间充质干细胞已被证明对皮肤再生具有多种治疗作用,可注射水凝胶具有良好的生物相容性和可调节性,可以提高干细胞治疗的效果。目的:以负载人脐带间充质干细胞的水凝胶为切入点,观察其对小鼠糖尿病皮肤创面的疗效,并探索可能的作用机制。方法:①链脲佐菌素溶液连续腹腔注射5 d构建C57BL/6J小鼠糖尿病模型,经尾静脉采血测血糖值评估模型是否建立成功。②造模成功后,利用打孔器建立小鼠背部皮肤损伤模型,水凝胶组给予纯水凝胶敷胶治疗,复合水凝胶组给予负载有人脐带间充质干细胞的水凝胶治疗,对照组给予等量生理盐水治疗,治疗第7,14天观察创面愈合情况。结果与结论:①敷胶后的14 d内,水凝胶组、复合水凝胶组小鼠皮肤创面面积明显低于对照组(P<0.05),复合水凝胶组的皮肤创面面积明显低于水凝胶组(P<0.05);②苏木精-伊红染色结果显示:复合水凝胶组创面肉芽组织新生率明显高于水凝胶组和对照组(P<0.05);③Masson染色结果显示:与对照组和水凝胶组相比,复合水凝胶组创面组织胶原沉积率明显增加(P<0.05);④免疫组化CD31染色结果显示:复合水凝胶组创面组织中新生微血管数量明显高于水凝胶组和对照组(P<0.05);⑤免疫组化CD45染色结果显示:与对照组和水凝胶组相比,复合水凝胶组创面组织中炎症面积明显减少(P<0.05);⑥免疫荧光染色和qRT-PCR结果显示:与对照组和水凝胶组相比,复合水凝胶组创面组织中M2巨噬细胞及其标志性因子白细胞介素10表达显著升高,且M1巨噬细胞及其标志性因子白细胞介素6表达明显降低(P<0.05);⑦上述结果提示:负载人脐带间充质干细胞的氯化壳聚糖-β-甘油磷酸钠复合水凝胶通过促进糖尿病创面肉芽组织和微血管形成,减轻炎症反应,从而促进创面愈合。

gAd重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

为了建立人脂联素球状结构域(gAd)原核高效表达体系,分离纯化gAd并检测其生物活性,从淋巴细胞中提取人基因组DNA,PCR扩增出含有脂联素编码序列的片段,通过T-A克隆的方法克隆入pMD18-T载体中,然后设计适当的引物引入起始密码、终止密码以及相应的酶切位点,把脂联素球状结构域(gAd)基因亚克隆到表达载体pBV220,将序列鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌DH5α中,用42℃温控诱导目的蛋白的表达;超声破菌,分离纯化包涵体,8mol/L尿素溶解,采用梯度稀释法复性重组蛋白,动物实验测定其活性。结果在大肠杆菌中成功实现了gAd稳定的以包涵体形式的高效表达,表达量约占全菌蛋白的20%,经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定分离得到的包涵体具有较高纯度,复性后具有降低家兔血糖和游离脂肪酸的作用。为进一步研究gAd的生物学活性、作用机制奠定了基础。

蚯蚓脱氧核糖核酸酶纯化及酶学性质(英文)

目的:从蚯蚓组织中纯化得到一种脱氧核糖核酸酶(取名为蚯蚓脱氧核糖核酸酶,简称EDNase)并研究其酶学性质。方法:采用丙酮沉淀、离子交换层析、高效液相层析、SDS-PAGE电泳,毛细管等点聚焦电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱等方法。结果:经证实这种纯化方案的纯化倍数是137,酶得率为45.6%。EDNase的相对分子质量约为63000。Mg2+,Mn2+和Ca2+对酶活性有较强的抑制作用,而Na+则轻微的提高酶的活性。在pH4.4～5.2的范围内EDNase酶活性稳定,其最适pH值为4.8。该酶的最适温度为37℃,在40℃范围内酶具有较高的稳定性。EDNase的等电点为6.20。在以小牛胸腺DNA为底物的条件下,酶的Km为1.52g/L,Vmax为4.89mg/(mL·min)。该酶可有效降解超螺旋质粒DNA,线状λ-噬菌体DNA和细菌染色体DNA,对RNA未见任何降解作用。结论:这种酶具有独特的酶学性质,不同于以往所知的脱氧核糖核酸酶。

PVAX-MAGE-1基因疫苗延缓小鼠肝癌细胞H22腹水瘤和实体瘤的生长

为观察重组基因疫苗PVAX-MAGE-1的抑瘤效应,构建黑色素瘤抗原-1(melanoma antigen-1,MAGE-1)真核基因表达载体--PVAX-MAGE-1.以重组质粒免疫C57BL/6小鼠后,ELISA法检测表明,与对照鼠(PVAX-1和生理盐水注射小鼠)比较,免疫小鼠脾淋巴细胞上清液中的细胞因子IL-2和IFN-γ明显升高(P<0.05);淋巴细胞-肿瘤细胞混合培养证明,免疫小鼠外周血CD8+T细胞对靶细胞的特异性杀伤作用明显增强(P<0.05).体内实验证明,PVAX-MAGE-1免疫C57BL/6小鼠,可显著延缓移植性H22腹水瘤及实体瘤在小鼠体内的生长.实验结果提示,重组基因疫苗PVAX-MAGE-1有明显的延缓肿瘤生长的作用,其抑瘤作用与提高T淋巴细胞IL和IFN表达,增强对肿瘤杀伤作用直接相关.

β－连环素通路对转化生长因子β1致肺纤维化的调控作

目的探讨β－连环素通路对转化生长因子β1（TGF－β1）致肺纤维化的调控作用。方法体外培养的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（RLE－6TN细胞）分为四组：A1.对照组；B1.加5 μg/L TGF－β1的TGF－β1组；C1.转染真核表达载体pcDNA3.0（pcDNA）后加5 μg/L TGF－β1的pcDNA＋TGF－β1组；D1.转染β－连环素敲除载体[F－（β－TrCP）－Ecad]后加5 μg/L TGF－β1的F－（β－TrCP）－Ecad＋TGF－β1组。24 h后，显微镜下观察各组细胞形态，Western印迹法检测各组细胞上皮钙黏素、α－平滑肌肌动蛋白（α－SMA）和纤维连接蛋白（Fn）表达；实时荧光定量－聚合酶链反应（RT－PCR）检测各组细胞培养上清液中促纤维化转录产物Snail mRNA的表达。体外培养的大鼠肺泡巨噬细胞（CRL－2192细胞）分为五组：A2.对照组；B2.加20 μg/L干扰素γ的干扰素γ组；C2.加10 μg/L TGF－β1和20 μg/L干扰素γ的TGF－β1＋干扰素γ组；D2.转染F－（β－TrCP）－Ecad后加入C2组相同试剂的F－（β－TrCP）－Ecad＋TGF－β1＋干扰素γ组；E2.转染野生型β－连环素表达载体（WTβ－连环素）后加入C2组相同试剂的WTβ－连环素＋TGF－β1＋干扰素γ组。24 h后，Western印迹法检测A2、B2、C2组中β－连环素蛋白的表达；RT－PCR检测各组细胞培养上清液诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的表达。结果B1、C1组RLE－6TN细胞形态变为梭形，D1组细胞形态基本呈铺路石样；B1、C1组RLE－6TN细胞纤维细胞特征蛋白α－SMA、Fn蛋白及下游促纤维化转录产物Snail mRNA表达均显著高于A1组，而上皮细胞特征蛋白上皮钙黏素蛋白表达显著低于A1组；D1组细胞α－SMA、Fn蛋白、Snail mRNA表达均显著低于C1组（0.352±0.076比0.937±0.303、0.319±0.072比0.903±0.211、3.675±0.642比9.708±2.031），而上皮钙黏素蛋白表达显著高于C1组（1.482±0.227比0.604±0.121）（均P〈0.05）。CRL－2192细胞中，β－连环素蛋白表达水平低且A2、B2、C2组β－连环素蛋白表达差异无统计学意义；B2组iNOS mRNA表达显著高于A2、C2、D2、E2组（64.95±4.47比9.87±0.73、21.32±2.41、18.35±3.61、22.87±3.14）（均P〈0.01），C2、D2、E2组iNOS表达均高于A2组（均P〈0.05），而C2、D2、E2三组间比较差异无统计学意义。结论阻断β－连环素通路可抑制TGF－β1诱导的上皮细胞间质转化而不影响其抗炎作用，从而实现β－连环素通路对TGF－β1致肺纤维化作用的调控。