福尔马林皮下注入引起大鼠脊髓背角表层神经元Fos蛋白和蛋白激酶Cβ亚型的共同表达 :免疫细胞化学双标法研究(英文)

目的 :研究慢性伤害性模型大鼠脊髓背角表层神经元中Fos蛋白和蛋白激酶Cβ亚型的表达间的关系。方法 :用免疫细胞化学双标技术 ,观察了大鼠一侧后脚掌注射福尔马林 1h后 ,脊髓腰段背角神经元中Fos蛋白和蛋白激酶Cβ亚型 (PKCβ)的表达及二者的共存情况。结果 :1)注射侧背角表层中有大量Fos蛋白样免疫组化染色阳性神经元出现 ,且其中一半以上同时有PKCβ样免疫反应的增强 ,而背角表层中有PKCβ样免疫反应增强的神经元中 ,只有 1/5同时有Fos蛋白样阳性反应出现 ;2 )在注射侧背角Ⅴ～Ⅶ层中也有少量Fos蛋白样阳性反应神经元出现 ,但它们都不出现PKCβ LI反应的增强。结论 :背角表层中的双标免疫阳性神经元可能与慢性伤害性输入引起的脊髓过敏状态的形成有关。

中枢神经元树突电活动和树突返传动作电位在突触可塑性调控中的作用--悼念树突功能研究的先驱张香桐院士

本文回顾了张香桐院士在上世纪50年代完成的有关神经元树突电活动和功能特性的先驱性研究工作,简要介绍了此后成为神经科学研究热点之一的树突在中枢突触传递和突触可塑性形成中所起作用的研究概况,籍以说明张香桐院士不愧为神经科学研究历史上做出过突出贡献的人物之一。

外周formalin刺激时大鼠脊髓灰质神经元c-Fos蛋白和NMDA受体的双标记免疫细胞化学研究(英文)

利用免疫细胞化学双标技术，研究了大鼠后脚掌注入ｆｏｒｍａｌｉｎ时脊髓ｃ－Ｆｏｓ蛋白和ＮＭＤＡ受体在脊髓灰质不同层次神经元的分布。结果表明，脊髓背角Ⅰ－Ⅱ层、Ⅴ－Ⅵ层、和Ｘ层中的Ｆｏｓ样免疫反应阳性神经元中分别有２８．６％，５８．１％和６４．８％呈现ＮＭＤＡ受体样免疫反应阳性。此结果提示长时间的外周伤害性刺激作用时，脊髓不同层次的伤害性感受神经元可能由于ＮＭＤＡ受体分布的不同而在持续痛刺激过程中起着不同的作用。

大鼠脊髓背角浅层中γ-氨基丁酸能神经末梢与含NMDA样受体或蛋白激酶C样受体神经元之间突触联系的电镜研究

本研究利用受体自显影方法探讨了孤啡肽 (nociceptin/orphaninFQ)在外周炎症和痛觉过敏中的调制作用。将完全弗氏佐剂 (CFA)注射到大鼠一侧后脚掌 2d、4d或 8d后 ,分别进行脊髓C4[3H]孤啡肽结合物的定量测定。放射自显影光密度测定分析表明 ,注射CFA 4d后的动物与对照组相比 ,两侧脊髓Ⅰ -Ⅱ层的中间和外侧区均有 [3H]孤啡肽结合物的明显增加 ;而X层中放射性结合物没有任何改变。生化研究证实 ,[3H]孤啡肽与大鼠脑片的特异性结合 [3H]孤啡肽受体的结合特征是一致的。以上结果提示 ,脊髓 [3H]孤啡肽受体在痛觉过敏期间发生了上调 ;该反应可能通过增强内源性镇痛机制以减弱CFA引起的痛觉过敏。

c-fos基因的反义寡聚脱氧核苷酸鞘内注入减弱福尔马林引起的大鼠伤害性行为反应及脊髓背角Fos蛋白和强啡肽 A表达的研究(英文)

本研究通过鞘内注射 c-fos反义寡聚脱氧核苷酸 (antisense oligodeoxynucleotide,AS-ODN)封闭背角中 F os蛋白的表达 ,观察了 Fos蛋白合成和慢痛反应的关系 ,并分析 Fos蛋白合成和强啡肽 A(Dyn A)表达之间的关系。实验组动物 (n=5 )鞘内预先注射 c-fos的 AS-ODN(5 0μg,5μl) ,另两个对照组 (每组 n=5 )分别注射等量生理盐水和 AS-ODN的反序核苷酸 (reverseoligodeoxynucleotides,RS-ODN,5 0μg,5μl) ;4h后 ,各组动物均在一侧后肢脚掌皮下注射 formalin(5 % ,5 0μl) ,并立即用计算动物舔拭注射侧后脚掌累计时间的方法 ,检测大鼠的伤害性行为反应 ,行为检测后 1h处死动物 ,用免疫组化方法检查脊髓背角中 Fos蛋白阳性神经元的数量和强啡肽 A(1～ 8)的表达量。结果发现 ,和两个对照组相比 ,实验组动物 Formalin诱发的伤害性行为反应的第二相明显减弱 ,同时 Form alin注射侧背角 F os蛋白样免疫阳性细胞的数量和 Dyn A含量的灰度值明显减少。本研究结果提示 ,外周伤害性刺激引起的长期持续的痛反应是以 c-fos基因表达增加及受其调控的 Dyn A表达上调为基础的 ,由此推测在脊髓背角神经元中 Fos蛋白和 Dyn

5-HT对弓状核神经元的直接兴奋作用和通过GABA能局部神经元实现的抑制作用(英文)

用大鼠离体灌流脑片的细胞外单一神经元电生理记录技术 ,观察了 5 HT对弓状核神经元自发放电的影响。结果表明 :(1)在随机选取的 149个神经元中 ,有 33个 (2 2 .2 %)可被 5 HT兴奋 ,82个 (5 5 .0 %)被抑制 ,其余 34个 (2 2 .8%)出现双相反应或不出现反应 ;(2 )用低Ca2 + 高Mg2 + 人工脑脊液替换正常人工脑脊液后 ,5 HT引起的兴奋效应仍可出现 ,但 5 HT引起的抑制效应不再出现 ;3) 5 HT受体的非选择性拮抗剂cyproheptadine对5 HT引起的兴奋或抑制都有阻断作用 ;(4 )用GABA受体拮抗剂bicuculline (Bic)可以阻断 5 HT引起的抑制作用。据此推测 :(1) 5 HT的兴奋效应对低Ca2 + 环境不敏感 ,因而是 5 HT直接作用于所记录细胞的结果 ;(2 ) 5 HT的抑制效应对低Ca2 + 敏感 ,并可被Bic所阻断 ,因而 5 HT可能是先兴奋了局部GABA能中间神经元 ,后者再通过释放GABA抑制了所记录的神经元。

β-淀粉样蛋白31-35片段对海马神经元分离膜片Ca^(2+)激活大电导钾通道的抑制

为了确定β－淀粉样蛋白（ＡβＰ）在影响神经元电生理特性并导致神经毒作用时的最短活性序列，实验采用膜片钳技术，在急性分离的大鼠海马ＣＡＩ区锥体细胞的“内面向外”式膜片上，观察了ＡβＰＲ的３１－３５和２５－３５片段对Ｃａ２＋激活大电导钾（ＢＫ）通道活动的影响。结果显示，浴液中给予 ５μｍｏｌ／Ｌ的ＡβＰ ３１－３５后，ＢＫ通道的平均开放概率（Ｐｏ）和开放频率在１～３ｍｉｎ内分别减少了８５．８％（Ｐ＜０．０１）和７２．１％（Ｐ＜０．０１）；平均开放时间减少了４１．１％（Ｐ＜０．０１）；平均电流幅度则无明显改变（Ｐ＞０．０５）；给子同样摩尔浓度的ＡβＰ ２５－３５后，ＢＫ通道平均Ｐｏ减少了８５．５％（Ｐ＜０．０１），平均开放时间减少了５１．４％，（Ｐ＜０．０５）。结果提示，两种ＡβＰ片段对海马神经元ＢＫ通道具有抑制作用，这可能与ＡβＰ的神经毒性作用有关；ＡβＰ３１－３５片段可能是ＡβＰ分子中影响细胞电生理特性的最小活性序列。

溶血磷脂酸对β-淀粉样蛋白片段AβP31-35所致小鼠大脑皮层离体神经元凋亡的神经保护作用(英文)

已报道低浓度溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)对去血清培养所致的神经元凋亡有神经保护作用.为了进一步观察LPA是否对β-amyloid peptide fragment 31-35(AβP31-35)所致的神经元凋亡也起类似的作用,本研究应用DNA电泳分析、HO33342和TUNEL染色法等技术,对培养的小鼠大脑皮层神经元进行了观察.结果显示,只有使用较低浓度的LPA(1～10μmol/L)、并且将此剂量的LPA比AβP31-35提前12～24 h加入培养液时,才可看到LPA明显削弱了AβP31-35所致的神经元凋亡.以上结果表明,适当浓度的LPA在长时间预作用的条件下,可对AβP31-35所致的皮层神经元凋亡起保护因子或抗凋亡因子的作用,但其作用途径可能较在去血清培养所致的凋亡时更为复杂,因为在去血清的同时加入LPA就能制止去血清所致的凋亡.

蛋白激酶C部分参与伤害性刺激在脊髓背角神经元中引起的c-fos蛋白的表达而可能不参与阿片受体对脊髓痛感受的调制(英文)

实验用免疫细胞化学技术观察了大鼠鞘内分别注入蛋白激酶(PKC)抑制剂Chelerythrine(Chel)、纳洛酮(Nal)、或二者同时注入后,由后脚掌注射福尔马林引起的脊髓腰膨大背角中c-fos蛋白样免疫活性(Fos-LI)神经元数目的改变。结果发现:(1)鞘内注入Chel可显著降低福尔马林注射侧脊髓背角中Fos-LI神经元的数目,同空白对照组(鞘内注入生理盐水或10％的DMSO)相比,降低60.3％(P<0.001):(2)鞘内注入Nal后,福尔马林注射侧背角中Fos-LI神经元显著增加,同对照组相比,增加46.0％(P<0.01),而以背角深层增加最为明显;(3)在鞘内同时注入Chel和Nal后,与单独注入Nal组相比,脊髓背角中Fos-LI神经元的数目显著降低(降低53.2％),此数值与上述单独注入Chel时引起Fos-LI神经元降低的百分率近似。结果提示:(1)PKC只参与脊髓背角中部分Fos-LI神经元中c-fos蛋白的表达;(2)PKC可能不参与背角中同时激活的μ-(以及部分δ-)阿片受体对脊髓伤害性感受的调制。

纹状体边缘区P物质和小清蛋白阳性神经元参与运动疲劳所致大鼠认知功能下降

目的:通过检测运动疲劳后大鼠纹状体边缘区(marginal division,Mr D)内与学习记忆相关分子的表达变化情况,揭示运动疲劳导致学习记忆能力下降的神经生物学机制。方法:雄性SD大鼠随机分为对照组(CG)和运动疲劳组(EG),采用免疫组织化学方法观察大鼠纹状体边缘区P物质(substance P,SP)和小清蛋白(parvalbumin,PV)表达变化情况,并通过Y迷宫主动回避实验,测试大鼠的学习记忆能力。结果:SP免疫阳性纤维沿背腹方向呈带状密集分布于Mr D内,PV阳性细胞多层密集平行排于Mr D内,形态呈梭形,明显区分于纹状体其他区域。EG大鼠Mr D内SP阳性纤维染色灰度值和PV阳性细胞密度均显著低于CG大鼠(P<0.05,P<0.01),并且EG大鼠的学习记忆能力也显著低于CG(P<0.05,P<0.01)。结论:运动疲劳导致大鼠纹状体边缘区学习记忆相关分子SP和PV表达的显著下降的同时其学习记忆能力也明显降低,提示纹状体边缘区参与了运动疲劳所致的认知功能下降的神经调控过程。

c-fos反义寡聚核苷酸对亚硒酸钠引起的皮质神经元凋亡的保护作用(英文)

本文利用 c-fos ASO(反义链全部硫代磷酸化修饰 )技术阻断 c-fos的表达 ,观察此项处理对亚硒酸钠在体外培养皮质神经细胞致凋亡作用和相关基因表达改变的影响。结果显示 :( 1) c-fos ASO可阻断亚硒酸钠的致凋亡作用 ,且有一定的剂量和时间依赖性 ;用琼脂糖凝胶电泳分析由各个时间点提取的 DNA片段 ,与对照组比较 ,c-fos ASO能明显阻断亚硒酸钠诱导的典型的 DNA梯型 ;用流式细胞仪检测得到的 DNA含量直方图也显示 ,在 c-fos ASO处理后 ,与对照组比较 ,亚硒酸钠引起的亚二倍体峰变小 ;( 2 )用 RT-PCR法检测表明 ,在用 c-fos ASO和亚硒酸钠处理皮质神经细胞后 ,不仅阻断了 c-fos表达的上调 ,对其它几种基因表达的改变也有不同的影响 ,与对照组比较 ,c-fosm RNA在各个时间点 ( 0 .5、1、2、4和 2 4h)不再上升 ,bcl-2 m RNA则不再下降 ,bax m RNA和 ACh E m RNA都不再上升 ;唯一不同的是 ,p5 3m RNA的变化趋势则与未经 c-fos ASO预处理时基本相同 ,在多数时间点两组 p-5 3m RNA水平之间无显著性差异 ( P>0 .0 5 ) ,说明此基因的表达基本不受 c-fos ASO作用的影响。上述结果提示 ,亚硒酸钠诱导的神经元凋亡可能是一组级联式基因表达更变的结果 ,c-fos是其中的一个组成成员 ,它的表达改变被阻断后 ,处于它下游?

溶血磷脂酸对培养小鼠大脑皮层神经元的双重作用:抗凋亡和促凋亡(英文)

应用DNA电泳分析、H033342和TUNEL染色法、以及部分地使用透射电镜技术,检测了不同浓度的溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)对离体培养的小鼠大脑皮层神经元存活情况的影响。结果显示,低浓度的LPA(0.1-30μmol/1)对去血清培养所致的皮层神经元凋亡有浓度依赖性的保护作用,而较高浓度的LPA(>50μtmol/L)不仅不表现这种保护作用,而且可引致培养在含血清的完全培养基中的皮层神经元出现凋亡。以上结果表明,适当浓度的LPA对凋亡的皮层神经元起着保护因子或抗凋亡因子的作用,而较高浓度的LPA则起着促凋亡因子的作用。

溶血磷脂酸促进离体大鼠胚胎神经干细胞的增殖及其向胆碱能神经元分化(英文)

溶血磷脂酸（1ysophosphatidic acid，LPA）是一种细胞外磷脂信号。本研究用[^3H]-胸腺嘧啶掺入法、免疫细胞化学和Western blot等技术，观察了LPA对体外培养的大鼠胚胎神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的增殖以及向MAF2标记的一般神经元和ChAT标记的胆碱能神经元的分化的影响。结果显示：（1）在特殊的无血清培养基中加入低浓度的LPA（0．01-1．0μmol/L）后，NSCs对【^3H】-胸腺嘧啶的摄入呈剂量依赖性增加，表明LPA对NSCs有显著的促增殖作用；（2）在培养基中加入胎牛血清以诱导NSCs的分化，发现低浓度的LPA增加MAF2阳性和ChAT阳性神经元的比例，0．1μmol／L LPA引起的增加达到峰值；（3）Western blot分析显示LPA促进了MAP2和ChAT的表达；（4）在诱导NSCs出现分化早期，用倒置显微镜观察到低浓度的LPA明显促进细胞突起的生长和细胞的迁移。以上结果表明，低浓度LPA在一定范围内可以促进NSCs的增殖、并分化为一般的MAP2阳性神经元和特殊的胆碱能神经元，而且LPA可以促进在分化早期出现的神经元或神经胶质细胞前体细胞的迁移和突起生长。

溶血磷脂酸对离体培养的大鼠胚胎神经干细胞向神经胶质细胞分化的影响(英文)

本研究用免疫细胞化学荧光双标技术观察了溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)对大鼠胚胎神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化为少突胶质细胞(galactocerebroside-positive,Gal-C阳性)和星形胶质细胞(glial fibrillary acidic protein-positive,GFAP阳性)的影响,并且用RT-PCR技术对NSCs可能表达的LPA受体进行分析。结果显示:(1)加入不同浓度(0.01～3.0μmol/ L)LPA,第7天进行检测时,少突胶质细胞数量呈明显的剂量依赖性增加,峰值出现在1.0μmol/L LPA组,少突胶质细胞所占百分比从对照组的8.5%增加到32.6%;(2)星形胶质细胞的分化几乎不受LPA的影响,第7天时各LPA处理级星形胶质细胞百分比与对照组相比均无显著性差异;(3)RT-PCR结果显示,大鼠胚胎NSCs的LPA_1和LPA_3受体表达明显,而LPA_2受体表达很弱。以上结果表明,较低浓度的LPA可能作为细胞外信号,通过LPA_1和LPA_3受体促进大鼠胚胎NSCs向少突胶质细胞分化和生成,但对星形胶质细胞的分化过程无明显影响。

β-淀粉样蛋白片段31～35 诱导体外皮质神经元凋亡的时程观察和相伴随的某些基因的表达变化(英文)

在过去工作证实人工合成的β淀粉样蛋白片段３１～３５（Ａβ３１～３５）诱发体外培养的新生小鼠大脑皮质神经元凋亡的基础上，本研究探讨了这一凋亡的详细时程和一些相关基因表达的变化。结果显示：（１）用荧光细胞核染料ＰＩ染色，观察到Ａβ３１～３５ 处理后１ ｈ 开始出现神经元核染色质凝聚，２ ｈ 可看到核沟出现和大小不等的核片块，在３，４ 和２４ ｈ 出现越来越多的核片块，但不同细胞核的变化不同步，即有些细胞出现核损害的同时，也有核正常的细胞存在；（２）用琼脂糖凝胶电泳分析各时间点提取的ＤＮＡ，梯型现象最早出现在Ａβ３１～３５ 处理后２ ｈ，随着时间延长越来越明显；（３）用流式细胞仪检测ＤＮＡ 含量直方图显示，亚二倍体细胞最早出现在Ａβ３１～３５ 处理后２ ｈ，其数量随时间延长逐渐增多；（４）用免疫荧光流式细胞仪检测某些基因编码的蛋白产物的表达量表明，ｂｃｌ２ 蛋白表达在Ａβ３１～３５ 处理后１ ｈ 出现明显减少，以后缓慢降低，至２４ ｈ达最低点。与此相反，ｂａｘ 蛋白表达在１～４ ｈ 期间呈现稳定上调，而ｐ５３ 和ｃｆｏｓ 两种蛋白表达也显示上调，其ｐ５３ 蛋白在２ ｈ 达最高峰，ｃｆｏｓ 蛋白则在２ ｈ 开始上调；

探讨单细胞记录和神经细胞培养时神经元的分离方法

目的探讨针对不同实验目的皮层神经元的最佳分离方法。方法针对单细胞记录分别采用蛋白酶E分离法和胰蛋白酶分离法分离神经元,针对神经细胞培养分别采用胰蛋白酶分离法和机械分离法,之后通过形态学、膜片钳和染色法等方法分别比较上述分离方法对神经元活性的影响。结果经蛋白酶E或胰蛋白酶分离法得到的细胞在进行单细胞记录时虽然细胞的死亡率没有区别,但形态学、膜片钳等实验均表明蛋白酶E分离法分离的神经元活性更好;在神经细胞培养中经形态学、膜片钳和台盼蓝染色法和凝胶电泳等方法都表明胰蛋白酶分离法分离的神经元活性好,更适于神经细胞培养。结论单细胞记录时蛋白酶E分离法更为合适,神经细胞培养时胰蛋白酶分离法更为合适。

大鼠海马神经元大电导钙激活钾通道的全细胞电流记录

目的探讨记录全细胞的大电导钙激活钾通道的技术方法。方法首先酶解急性分离大鼠海马神经元;利用全细胞膜片钳技术记录大电导钙激活钾电流。结果可记录到一系列快速的外向钾离子电流。结论所记录到的外向钾离子电流中,快速出现并很快减小的呈尖峰样的瞬变外向电流主要由大电导的钙激活钾电流组成。

NAME对大鼠学习记忆过程中突触可塑性改变的影响:超微结构研究(英文)

用一次性被动回避反应和 Morris水迷宫两种学习记忆模型 ,对大鼠侧脑室注射 NOS抑制剂 Nω-nitro- L- arginine(NAME)前后海马 CAI区和大脑皮质额叶中突触形态的超微结构变化作了比较 ,结果发现 :1在两种模型都观察到 ,单纯行为训练或训练前给以 NAME,未能看到突触面积、囊泡直径以及突触界面曲度等较粗大的结构指标的改变 ;2但对于一些细微的结构指标 ,如突触后致密带厚度、突触间隙宽度以及其他一些囊泡体视学指标等 ,则单纯行为训练引起它们的明显改变 ,而预先注射 NAME不仅在行为上阻碍了学习记忆的形成 ,也可使这些形态学改变明显减弱。上述结果提示 ,NO参与了作为学习和记忆基础的某些突触可塑性改变的出现。

毁损Meynert基底核造成的大脑皮层及海马β-淀粉样蛋白和τ蛋白的增加:行为学和形态学研究(英文)

通过毁损Wistar大鼠Mevnert基底核建立Alzheimer's病动物模型。用Morris水迷宫检测动物的行为变化，用β-淀粉样蛋白（β-AP）和τ蛋白疫细胞化学技术反应脑切片．用图象分析系统测算海马及皮层阳性神经无数目／μm2，以评价毁损胆碱能神经与Alzheimer's时特殊蛋白β-AP及τ蛋白的关系。结果显示，毁损Meynert基底核大鼠寻找逃避平台的时间延长，模型动物脑新皮层及海马的β-AP及τ蛋白样免疫反应阳性神经元明显增加.此变化在毁损Meynert基底核9～10个月动物比毁损3～4个月动物更为显著。本研究证明：胆硷能系统受损导致脑皮层及海马的β-AP及τ蛋白过度表达，可能是散发性Alzheimer's病的重要病因。