ITGA2B基因复合杂合突变所致遗传性血小板无力症家系分析及致病机制研究

目的对一个ITGA2B基因复合杂合突变导致的遗传性血小板无力症家系进行表型及基因型研究,并探索其分子致病机制。方法使用二磷酸腺苷、胶原、肾上腺素、花生四烯酸及瑞斯托霉素等诱聚剂进行血小板聚集试验,检测先证者及家系成员的血小板聚集率。通过流式细胞术检测血小板表面CD41(αⅡb)、CD61(β3)、CD42b(GPⅠb)的表达。采用基因测序技术进行基因鉴定。利用RT-PCR检测ITGA2B基因mRNA剪接情况,qRT-PCR检测ITGA2B基因mRNA相对水平。生物信息学分析评估突变位点的致病性及对蛋白结构和功能的影响。通过Western blot检测分析血小板总αⅡb、β3的表达。结果除瑞斯托霉素外其他4种诱聚剂均无法使先证者血小板聚集。流式细胞术检测先证者血小板表面αⅡb的表达仅为0.25%,β3弱表达为9.76%,而GPⅠb表达相对正常,其余家系成员膜糖蛋白表达基本正常。基因测序结果显示先证者存在ITGA2B基因c.480C>G与c.2929C>T复合杂合突变,其中c.480C>G突变遗传自其母亲,c.2929C>T遗传自其父亲。RT-PCR及测序结果表明c.480C>G突变导致先证者及其母亲发生c.476G-574A(p.S160-S192)共99个碱基缺失的mRNA剪接。qRT-PCR检测发现c.2929C>T突变导致先证者及其父亲ITGA2B基因mRNA水平减低。生物信息学分析提示c.480C>G突变形成了与hnRNP A1蛋白结合序列,产生了5'SS剪接位点。αⅡb亚基的蛋白三维结构模型显示,p.S160-S192缺失的β-propeller结构域第2 blade缺失两条β链和一个α螺旋;c.2929C>T无义突变使得翻译提前终止产生p.R977-E1039缺失的截短型蛋白,包括胞质域(CD)、跨膜域(TM)以及胞外Calf-2结构域一条β链的缺失。Western blot检测先证者血小板总αⅡb表达缺失、β3的相对表达量为正常人的11.36%。结论ITGA2B基因第4外显子c.480C>G与第28外显子c.2929C>T的复合杂合突变是本家系遗传性血小板无力症的致病原因。

一个新的F10基因缺失突变所致遗传性凝血因子Ⅹ缺陷症家系及其致病机制研究

目的对一个新的F10基因缺失突变导致遗传性凝血因子Ⅹ(FⅩ)缺陷症家系进行基因突变分析, 并研究其分子致病机制。方法通过全外显子二代测序(NGS)筛选出先证者的F10基因突变位点, 采用Sanger测序法进行验证。血液凝固法检测先证者及其家系成员的FⅩ活性, Sanger测序法分析其家系成员F10基因突变位点。采用Mutation Taster在线生物信息学软件预测突变的致病性;采用SWISS-MODEL软件模拟野生型和突变型三维蛋白模型分析突变对蛋白结构和功能的影响并对野生型和突变型FⅩ蛋白催化残基进行差异分析。通过构建质粒, 转染人胚肾293T细胞(HEK 293T), RT-PCR方法分析突变位点的剪接情况, 采用qRT-PCR的方法对F10基因mRNA水平进行定量分析, 酶联免疫吸附试验(ELISA)方法分别检测细胞裂解液和细胞培养基(细胞内外)的FⅩ抗原水平。结果血液凝固法检测先证者FⅩ活性为36.43%。NGS分析发现先证者F10基因第8号外显子携带一个缺失的杂合突变c.902919del(p.Ala301Glu306del), Sanger测序分析显示其家系部分成员(母亲与外祖父)也检测到相应的缺失突变。在线生物信息学软件预测显示c.902919del突变为致病突变, 致病分数为0.999;三维蛋白结构模型分析显示c.902919del突变导致蛋白结构一段β折叠消失使得前一段β折叠长度减短, 并且造成与其相邻氨基酸连接的氢键丢失, 关键催化残基的侧链构象与野生型相比无明显差异。mRNA剪接分析显示该突变未发生选择性剪接改变, qRT-PCR结果显示表达c.902919del突变型和野生型细胞中F10基因mRNA水平差异无统计学意义, ELISA结果显示突变型细胞培养基和裂解液的FⅩ∶Ag水平差异无统计学意义。结论该遗传性FⅩ缺陷症家系由F10基因第8号外显子的c.902919del(p.Ala301Glu306del)杂合缺失突变导致。