乳鼠心脏Sca-1^+干细胞定向分化的诱导研究

目的研究抗坏血酸(ascorbic acid,AA)即维生素C(vitamin C,Vc)、地塞米松(dexamethasone,DXMS)及促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对Sca-1+干细胞分化为心肌细胞的定向诱导作用。方法急性分离并培养C57BL/6J乳鼠心脏来源的Sca-1+干细胞至第3代或第4代,培养基中分别加入抗坏血酸、地塞米松及EPO,以不同的诱导方案促使其分化,分组如下:空白对照组、DMSO对照组、Vc诱导组、DXMS诱导组、EPO诱导组、Vc及DXMS联合诱导组。干细胞在不同诱导剂作用下持续培养3周,期间利用光镜观察细胞形态改变;第3周时进行Nkx2.5和cTnI免疫荧光染色来判断干细胞的分化效率。结果光镜观察显示,Sca-1+干细胞在抗坏血酸、地塞米松及EPO的诱导下,均有不同程度向心肌细胞分化的形态学变化。免疫荧光染色结果显示,分化细胞中的心肌细胞特异性标记物cTnI及Nkx2.5的阳性率均低于50%,其中cTnI阳性率分别为:空白对照组(9.41±1.67)%、DMSO对照组(10.42±3.20)%、Vc诱导组(14.84±1.99)%、DXMS诱导组(10.68±2.27)%、EPO诱导组(8.64±2.98)%、Vc及DXMS联合诱导组(44.27±22.91)%。与空白对照组相比,仅联合诱导组cTnI表达水平明显上调[(9.41±1.67)%vs(44.27±22.91)%,P<0.05],其余各组与空白对照组相比差异均无统计学意义。Nkx2.5在各组的阳性率较低,Vc及DXMS联合诱导组仅为(0.05±0.02)%,其余各组阳性率均低于该水平。结论抗坏血酸、地塞米松及EPO在Sca-1+干细胞分化为心肌细胞的过程中有一定的诱导作用,其中,抗坏血酸和地塞米松联合诱导组可在较高水平上诱导Sca-1+干细胞分化为心肌细胞。

小鼠Sca-1^+干细胞对心肌梗死模型小鼠的疗效及其基因调控机制

目的探讨小鼠干细胞抗原-1阳性(stem cell antigen-1-positive,Sca-1^+)干细胞(stem cells,SCs)对心肌梗死(myocardial infarction,MI)模型小鼠的疗效及其基因调控机制。方法采用免疫磁珠分选法急性分离2日龄及3、6、9、12月龄小鼠心脏Sca-1^+SCs;通过结扎8周龄小鼠心脏冠状动脉左主降支,建立小鼠急性MI模型,于心梗边缘区分别注射PBS和Sca-1^+SCs悬液。术后行超声心动图测定心功能,Masson三色染色、心重/体重比(HW/BW)用于评价各组Sca-1^+SCs对心脏结构的影响。将各组小鼠心脏Sca-1^+SCs进行全基因组测序,通过STEM软件对转录组基因表达水平进行聚类及GO富集分析,筛选出乳鼠和成年鼠差异表达的基因类型,并采用qRT-PCR法进一步验证目的基因的表达情况。结果 MI术后,与PBS组比较,乳鼠心脏Sca-1^+SCs治疗组小鼠左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室短轴缩短率(left ventricular fraction shortening,LVFS)均明显升高(P <0. 05),HW/BW明显降低(P <0. 05),左室舒张末内径(left ventricular diastolic internal diameter,LVIDd)明显减小(P <0. 05);与成年鼠比较,乳鼠心脏Sca-1^+SCs移植治疗可降低心肌梗死面积,缓解心腔扩大。在乳鼠心脏Sca-1^+SCs中高表达,而成年鼠表达降低的基因共185个,regulation of developmental process条目上富集基因有38个,其中肌球蛋白重链6(myosin heavy chain6 cardiac muscle alpha,Myh6)、胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,Igf2)、成骨细胞特异性因子(periostin,Postn)、神经元再生相关蛋白(neuronal regeneration related protein,Nrep)基因在乳鼠心脏Sca-1^+SCs中具有较高转录水平。与乳鼠比较,成年小鼠心脏Sca-1^+SCs中Myh6、Igf2、Postn、Nrep基因m RNA的表达水平均显著下调(P <0. 05)。结论乳鼠心脏Sca-1^+SCs移植对MI的疗效优于成年小鼠,其原因可能是乳鼠心脏Sca-1^+SCs中Myh6、Igf2、Postn、Nrep等基因的表达水平高于成年小鼠。

日本血吸虫重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂对小鼠心肌梗死预后的影响及其免疫调节机制

目的探讨日本血吸虫重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂(r Sjcystatin)对小鼠心肌梗死(myocardial infarction,MI)预后的影响及其免疫调节机制。方法建立小鼠MI模型,分别于术后1、3、5、7、14、28 d经腹腔注射PBS及10、25μg r Sjcystatin。术后28 d,记录MI小鼠的生存率及心脏黏连率;通过超声心动图观察心功能变化;Masson三色染色法检测心脏结构重构情况。术后7 d,HE染色法检测小鼠心脏损伤情况;CD45免疫组化染色法检测炎症细胞浸润程度;ELISA法检测小鼠血清中主要炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)、IL-6、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的分泌水平。结果MI术后28 d,与PBS组比较,两剂量r Sjcystatin治疗组小鼠存活率呈上升趋势,心脏黏连率降低;25μg r Sjcystatin治疗组小鼠左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室短轴缩短率(left ventricular fraction shortening,LVFS)明显升高(P<0.05),左室的梗死面积百分比明显减少(P<0.01);两剂量r Sjcystatin治疗组小鼠左室舒张末内径(left ventricular diastolic internal diameter,LVID,d)显著减小(P<0.05),左室壁厚度明显增加(P<0.001);与10μg r Sjcystatin治疗组比较,25μg r Sjcystatin治疗组的LVEF和LVFS均明显升高(P<0.05),LVID,d差异无统计学意义(P﹥0.05),左室梗死面积百分比显著减小(P<0.05),室壁厚度明显增加(P<0.001)。MI术后7 d,与PBS组比较,两剂量r Sjcystatin治疗组炎性细胞的浸润减少,心肌纤维的破坏减轻;25μg r Sjcystatin治疗组棕黄色炎性细胞颗粒的平均光密度值显著低于PBS组及10μg r Sjcystatin治疗组(P分别为<0.05和<0.001);与PBS组比较,25μg r Sjcystatin组小鼠血清TNF-α和IL-6的含量显著降低(P分别为<0.05及<0.01),TGF-β1含量显著升高(P<0.001),IL-10含量呈升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论r Sjcystatin可通过适度减弱炎细胞浸润、降低促炎因子TNF-α和IL-6分泌及增加抗炎因子IL-10和TGF-β1分泌,从而抑制小鼠MI后的炎症反应,延缓心肌结构重构的发生,对心肌有一定保护作用。