卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药和化疗敏感组织中的miRNAs差异表达谱检测及生物信息学分析

目的:寻找卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药及化疗敏感组织中microRNA的差异表达,为研究上皮性卵巢癌化疗耐药产生的分子机制及逆转其化疗耐药提供理论基础和依据。方法:首先,应用microRNA表达谱基因芯片寻找卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药及化疗敏感组织中差异表达的microRNAs;其次,选取部分差异表达的microRNAs应用RT-PCR实验检测技术在扩大的组织样本中进行验证;最后,运用生物信息学技术对符合要求的microRNAs进行相关生物信息学分析。结果:在microRNA表达谱基因芯片中筛选出与卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药相关的miR-27a-3p、miR-141-3p、miR-200b-3p等17个表达上调的miRNAs和miR-93-3p、miR-497-5p、miR-675-3p等15个表达下调的miRNAs。上调miRNAs预测的靶基因GO(BP模块)分析结果显示凋亡信号通路、Notch信号通路和凋亡过程,KEGG Pathway分析结果显示Wnt信号通路、PI3K-Akt信号通路和Erb B信号通路可能与化疗耐药存在相关性。下调miRNAs预测的靶基因GO(BP模块)分析结果显示负调控凋亡过程、Wnt信号通路生物学过程,KEGG Pathway分析结果显示PI3K-Akt信号通路、细胞循环可能与化疗耐药存在相关性。结论:MicroRNA表达谱基因芯片及生物信息学技术能为研究上皮性卵巢癌化疗耐药产生机制提供新的思路。miR-27a-3p、miR-141-3p、miR-200b-3p、miR-93-3p、miR-497-5p、miR-675-3p可能分别通过调控靶基因PRKCB、MAP2K4、PAK2、PRKAA1、CCNE1、IGF1R参与卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药。

血管紧张素-Ⅱ联合β-氨基丙腈腹腔注射建立主动脉夹层小鼠模型

目的血管紧张素-Ⅱ(Ang-Ⅱ)联合β-氨基丙腈(BAPN)腹腔注射建立小鼠主动脉夹层模型。方法 80只C57BL/6J小鼠(3周龄,雄性)分为对照组和7个实验组,分别为:Ang-Ⅱ组、BAPN 0.1 g/kg组、BAPN 0.33 g/kg组、BAPN 0.67 g/kg组、Ang-Ⅱ+BAPN 0.1 g/kg组、Ang-Ⅱ+BAPN 0.33 g/kg组、Ang-Ⅱ+BAPN0.67 g/kg组。对照组每8 h给予腹腔注射0.9%氯化钠注射液0.1 ml,Ang-Ⅱ组每8 h腹腔注射4.0 mg/kg Ang-Ⅱ,3种不同剂量的BAPN组每日分别给予腹腔注射0.1、0.33、0.67 g/kg BAPN, 3个联合用药组分别在每8 h腹腔注射4.0 mg/kg Ang-Ⅱ的基础上,分别给予腹腔注射0.1、0.33、0.67 g/kg BAPN。每组均于相同时间点应用鼠尾测压器检测并记录小鼠血压,持续14 d,中途死亡小鼠直接解剖,取出主动脉。14 d后处死小鼠,取出主动脉行病理观察。结果未注射Ang-Ⅱ的3个BAPN组小鼠血压与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);注射Ang-Ⅱ的4个组血压与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。对照组无主动脉夹层形成,HE染色显示血管壁结构完整;7个实验组HE染色显示部分小鼠血管壁弹力纤维破坏,假腔形成,炎性细胞浸润,提示主动脉夹层形成。BAPN 0.1 g/kg组、BAPN 0.33 g/kg组、BAPN 0.67 g/kg组,随着BAPN注入剂量的增加,主动脉夹层的发生率逐渐上升,分别为10%、30%、50%,部分小鼠因主动脉破裂死亡,3组分别为0、1、4只;Ang-Ⅱ组和Ang-Ⅱ+BAPN0.1 g/kg组主动脉夹层发生率较低(均为30%),死亡分别为1、0只;Ang-Ⅱ+BAPN 0.33 g/kg组和Ang-Ⅱ+BAPN0.67 g/kg组主动脉夹层发生率分别为70%和80%,Ang-Ⅱ+BAPN 0.33 g/kg组死亡2只,而Ang-Ⅱ+BAPN 0.67g/kg组8只形成主动脉夹层的小鼠均死亡。Ang-Ⅱ+BAPN 0.33 g/kg组主动脉夹层发生率高,死亡率不高,符合小鼠主动脉夹层模型的要求。结论 Ang-Ⅱ联合BAPN腹腔注射能成功诱导小鼠主动脉夹层模型。

宫颈癌与血浆微小RNA表达谱相关性的初步研究

目的探讨血浆微小RNA(mi RNA)在宫颈癌患者与健康人表达水平的差异性;筛选出差异较明显的血浆mi RNA。方法收集经病理确诊为宫颈浸润癌的患者血浆5例,作为试验组,同时选取5例相同年龄段健康体检人员作为对照组。对2组血浆中的mi RNA进行提取,利用Qiagen mi RNA PCR Array(384孔)对宫颈癌和健康人进行血浆mi RNA筛查,初步筛选出与宫颈癌相关的mi RNA表达谱。结果初步筛查出了差异表达的mi RNA,与健康人比较,以相差2倍为分界,宫颈癌血浆mi RNA共188个下调,25个上调。结合文献及P值进一步筛选出14个与宫颈癌相关的mi RNA。结论较明显差异表达的mi RNA可能与宫颈癌的发生、发展有一定的相关性。

miR-93-3p和CDC42在上皮性卵巢癌化疗耐药组织中的表达及临床意义

目的探讨miR-93-3p及CDC42在上皮性卵巢癌铂化疗耐药中的表达及临床意义。方法收集111例上皮性卵巢癌患者的组织学标本并分为敏感组和耐药组,通过靶基因预测网站预测miR-93-3p可能的靶基因为CDC42。采用实时荧光定量PCR检测miR-93-3p及CDC42在两组中的相对表达。比较两组miR-93-3p及CDC42的表达差异,分析上皮性卵巢癌组织中miR-93-3p、CDC42相对表达量与临床病理参数的关系。分析miR-93-3p和CDC42的相关性。结果 miR-93-3p在化疗耐药组中的表达水平明显低于敏感组(P <0.05);CDC42在化疗耐药组织中的表达较敏感组明显上调(P <0.05)。miR-93-3p与CDC42的表达呈负相关(r=-0.469,P <0.01)。结论 miR-93-3p在上皮性卵巢癌化疗耐药组织中低表达,可能通过靶向调控CDC42导致铂类化疗耐药。

miR-200b-3p和PAK2 mRNA在耐药卵巢癌组织中的表达及其临床意义

目的:探讨化疗耐药和化疗敏感患者卵巢癌组织中miR-200b-3p和PAK2 mRNA的表达水平及其临床意义。方法:采用生物信息学方法结合文献综合分析初步预测miR-200b-3p在卵巢癌组织中的靶基因为PAK2 ,收集山西省肿瘤医院2015—2018年的25例卵巢癌化疗耐药患者组织样本(耐药组)和25例卵巢癌化疗敏感患者组织样本(敏感组),采用实时荧光定量PCR法(qPCR)检测miR-200b-3p和PAK2 mRNA的相对表达量。比较两组患者肿瘤组织中miR-200b-3p和PAK2 mRNA的表达差异,并分析miR-200b-3p、PAK2 mRNA表达水平与上皮性卵巢癌患者临床病理指标的关系。结果:耐药组卵巢癌患者癌组织miR-200b-3p的表达水平显著高于敏感组卵巢癌患者,是敏感组的15.78倍;耐药组卵巢癌患者癌组织PAK2 mRNA的表达水平显著低于敏感组卵巢癌患者,是敏感组的0.03。miR-200b-3p和PAK2 mRNA表达水平呈负相关(r=-0.560,P <0.01)。结论:miR-200b-3p在化疗耐药性卵巢癌组织中过表达,可能是通过靶向调控PAK2 mRNA参与调节化疗耐药和促进卵巢癌转移。

miR-497抑制结肠癌细胞HCT116炎症相关基因表达的基因芯片研究

目的：采用基因芯片分析miR-497高表达对结肠癌细胞HCT116基因表达谱的影响。方法利用慢病毒感染人结肠癌细胞株 HCT116，建立 miR-497稳定高表达的结肠癌细胞模型HCT116-497细胞及阴性对照HCT116-CON细胞，用全基因组表达谱芯片筛选差异表达基因，利用MAS 3.0生物信息注释系统进行基因本体（gene ontology，GO）和信号通路富集分析（pathway analysis），筛选炎症相关基因。应用实时定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）对候选基因进行验证。结果筛选出绝对倍数变化（absolute fold change）3.0倍以上的下调基因582个，发现其主要富集于炎症相关细胞因子网络等信号通路。选取下调基因中参与细胞因子网络和MAPK信号通路的15个炎症相关基因进行PCR验证后显示，与 HCT116-CON 细胞相比，HCT116-497细胞中10个基因（CACNB1、FOS、IL-29、RPS6KA2、TNFSF15、IL-11、INHBC、CSF1R、JAK3和IL-2Rβ）表达水平降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），与芯片结果一致。结论 miR-497抑制结肠癌细胞HCT116中炎症相关基因mRNA的表达。

微小RNA let-7a对基底细胞样乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的检测微小RNA(miRNA,miR)let-7a在基底细胞样乳腺癌(BLBC)细胞株中的表达,探讨miR let-7a在BLBC细胞增殖、迁移及侵袭中的作用及其机制。方法BLBC细胞株MDA-MB-468、MDA-MB-231及非BLBC细胞株MCF-7购自中国科学院上海细胞生物学研究所,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测miR let-7a在以上细胞中的表达;使用Lipofectamin™2000脂质体转染miR let-7a至BLBC,Real-time PCR证实转染成功后,通过细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测对细胞生存率的影响,通过划痕实验及Transwell实验检测对细胞迁移和侵袭能力的影响;通过蛋白质印迹法(Western blot)检测STAT3蛋白的表达。应用SPSS 16.0统计软件分析,数据以均值±标准差(Mean±SD)表示。两组比较采用t检验,多组比较采用ANOVA。结果miR let-7a在BLBC细胞株MDA-MB-468、MDA-MB-231中的表达明显低于非BLBC细胞MCF-7(0.13±0.02比1.01±0.23,t=9.690,P<0.01;0.31±0.08比1.01±0.23,t=7.270,P<0.01),差异有统计学意义;与对照组比较,过表达miR let-7a后,MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞生存率较前下降(80.80±5.60比96.80±3.54,t=4.200,P<0.01和76.42±5.62比96.00±2.83,t=5.760,P<0.01),差异有统计学意义,过表达miR let-7a后,与对照组相比,MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞的迁移(24.17±2.93比41.33±2.80,t=10.110,P<0.01和18.50±3.27比34.17±3.19,t=6.770,P<0.01)与侵袭能力(55.17±11.64比78.50±5.91,t=3.460,P<0.01和48.33±6.10比68.50±3.09,t=3.440,P<0.01)下降,差异均有统计学意义;过表达miR let-7a后,MDA-MB-468与MDA-MB-231细胞中STAT3蛋白的表达量明显降低(0.53±0.08比1.00±0.12,t=8.390,P<0.01和0.38±0.06比1.00±0.13,t=8.600,P<0.01),差异有统计学意义。结论miR let-7a在基底细胞样乳腺癌中呈低表达;上调miR let-7a的表达,可以引起基底细胞样乳腺癌的增殖和侵袭转移力下降,其机制可能是通过抑制STAT3分子相关通路实现的。

miRNA-1在结直肠癌组织中的表达及其对结直肠癌DLD1细胞增殖和侵袭能力的影响

目的探讨miRNA-1(miR-1)在结直肠癌组织中的表达以及在体外对结直肠癌细胞增殖、侵袭能力的影响及其作用机制。方法选取2015年6月至12月山西医科大学附属肿瘤医院住院患者手术切除的结直肠癌组织180例和癌旁组织114例。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-1在58例结直肠癌组织、癌旁组织的表达情况;采用免疫组织化学方法检测基质细胞衍生因子1(SDF-1)蛋白在122例结直肠癌组织与56例癌旁组织的表达情况;采用瞬时转染法使结直肠癌细胞DLD1的miR-1过表达或敲低。用CCK-8法、克隆形成实验、Transwell实验分别检测过表达或敲低miR-1对DLD1细胞增殖、克隆形成和侵袭能力的影响;蛋白质印迹法检测过表达或敲低miR-1对DLD1细胞中SDF-1的表达的影响。结果RT-qPCR结果显示,miR-1在结直肠癌组织的表达较相应的癌旁组织降低(相对表达量比值<0.5),低表达率为82.8%(48/58)。免疫组织化学结果显示,SDF-1在结直肠癌组织中阳性表达率较癌旁组织高[81.1%(99/122)比8.9%(5/56),χ2=82.415,P<0.01]。细胞功能实验显示,与对照组(miR-1 NC)相比,转染miR-1模拟物的DLD1细胞增殖活性降低,克隆形成能力、侵袭能力减弱、SDF-1表达降低(P<0.05)。而转染miR-1抑制物的DLD1细胞与其对照组相比,细胞增殖活性、克隆形成能力、侵袭能力均显著增强、SDF-1表达水平提高(P<0.05)。结论miR-1在结直肠癌组织中低表达,可能通过调控SDF-1的表达而影响结直肠癌细胞的增殖和侵袭潜能,从而发挥抑癌基因的作用。