微小RNA-575靶向黑色素瘤缺乏因子2调控胃癌细胞的生物学特性

目的 通过寻找调控黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)的微小RNA(miRNA,miR),分析miRNA/AIM2轴对胃癌(GC)细胞生物学特性的影响.方法 采用R studio软件Limma软件包分析数据集GSE113255和GSE118897差异表达基因,通过韦恩图筛选出与细胞焦亡相关的共同基因,确定目标基因.收集2022年1月至2023年1月在山西医科大学附属运城市中心医院胃肠外科就诊的56例GC患者癌组织及癌旁组织,检测目标基因表达.在人GC细胞MKN45中过表达AIM2,采用碘化丙锭(PI)染色法、细胞计数试剂盒(CCK-8)法和Matrigel侵袭实验检测细胞凋亡、增殖及侵袭.利用Targetscan网站预测调控AIM2的miRNA,并采用荧光素酶报告基因检测AIM2启动子区与其结合情况.在MKN45细胞中转染miR-575类似物(miR-575 mimics)/阴性对照(NC mimics)或miR-575 抑制剂(miR-575 inhibitor)/阴性对照(NC inhibitor),采用 PI 染色法、CCK-8 法和 Matrigel侵袭实验检测细胞凋亡、增殖及侵袭能力.在MKN45细胞给予Ad-GFP/Ad-AIM2以及NC mimics/miR-575 mimics处理,采用蛋白质免疫印迹法、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测miR-575/AIM2轴对细胞焦亡和增殖的调控作用.组间差异采用t检验或方差分析(ANOVA)进行统计.结果 经分析发现AIM2蛋白差异最为明显,癌组织中AIM2蛋白及RNA水平均显著低于癌旁组织(蛋白:0.52±0.14 比 0.99±0.17,t=7.023,P<0.01;RNA:0.58±0.11 比 1.01±0.18,t=6.379,P<0.01).PI染色法、CCK-8法和Matrigel侵袭实验结果显示,Ad-AIM2组细胞凋亡数目显著高于Ad-GFP组[(43.52±3.08)%比(17.72±2.21)%,t=6.114,P<0.01],细胞增殖和侵袭能力显著低于Ad-GFP组(48h:1.17±0.18 比 1.45±0.22,t=5.027,P<0.05;72 h:1.58±0.36 比 2.31±0.42,t=4.822,P<0.05).利用Targetscan网站预测,并通过荧光素酶报告基因实验验证,发现miR-575与AIM2有互补的核苷酸序列,miR-575 mimics与野生型AIM2共转染后,miR-575 mimics组细胞荧光素酶活性显著低于 NC mimics 组(0.52±0.06 比 0.98±0.14,t=5.323,P<0.05);而 miR-575 mimics与突变型AIM2共转染后,miR-575 mimics组细胞荧光素酶活性较NC mimics组无显著变化(0.93±0.08 比 1.00±0.12,t=0.972,P>0.05).免疫印迹法结果显示,Ad-AIM2+miR-575 mimics组细胞凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、裂解的半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶1(cleaved Caspase-1)/Caspase-1以及高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的表达水平显著高于Ad-GFP+miR-575 mimics 组(ASC:1.62±0.31 比 0.73±0.19,t=4.302,P<0.05;cleaved Caspase-1/Caspase-1:1.44±0.21 比 0.78±0.16,t=3.198,P<0.05;HMGB1:1.32±0.14 比 0.81±0.11,t=5.029,P<0.05).结论 AIM2在GC中表达降低,miR-575通过靶向抑制AIM2的表达,进而抑制细胞焦亡,促进MKN45细胞的增殖侵袭.