AZD0530抑制wnt/β-catenin通路延缓青春期大鼠肾间质纤维化的实验研究

目的观察AZD0530治疗大鼠肾间质纤维化的实验效果。方法雄性2月龄SD青春期大鼠25只,分为假手术组(暴露左侧输尿管,5只)和肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)组(结扎左侧输尿管,20只)。实验1:假手术组和RIF组各5只大鼠,于术后4周处死,均取左侧肾脏制作组织学切片、应用Masson染色后计算胶原成分占比,应用免疫组织化学检测Fyn、α-SMA蛋白表达;应用PCR检测Fyn mRNA、α-SMA mRNA相对表达量;应用Western-blot检测Fyn、α-SMA蛋白表达。实验2:15只RIF组大鼠分为生理盐水(normal saline,NS)组(5只,NS灌胃/d)、5 mg组(5只,AZD0530灌胃5 mg·kg-1·d)、50 mg组(5只,AZD0530灌胃50 mg·kg-1·d),术后4周处死大鼠,检测项目同实验1。结果实验1,同假手术组相比,RIF组肾脏胶原成分占比高[(12.01±2.80)%比(0.79±0.27)%,t=8.91,P<0.001],免疫组织化学结果显示肾组织Fyn评分高[(4.06±0.37)分比(2.03±0.19)分,t=11.02,P<0.001]、α-SMA评分高[(4.92±0.48)分比(1.88±0.28)分,t=12.23,P<0.001],PCR检测结果显示肾组织Fyn mRNA相对表达量高[(4.64±0.66)倍比(1.00±0.02)倍,t=12.32,P<0.001]、α-SMA mRNA相对表达量高[(5.60±1.36)倍比(0.99±0.01)倍,t=7.600,P<0.001],Western-blot检测结果显示肾组织Fyn表达水平高[(0.26±0.04)比(0.10±0.03),t=7.35,P<0.001]、α-SMA表达水平高[(0.55±0.05)比(0.12±0.02),t=17.49,P<0.001]。实验2,经AZD0530治疗后,大鼠肾脏胶原成分占比降低[NS组(12.20±1.56)%,5 mg组(7.42±1.28)%,50 mg组(3.48±1.29)%,F=49.93,P<0.001],免疫组织化学结果显示肾组织Fyn评分无明显改变[NS组(4.22±0.67)分,5 mg组(4.17±0.63)分,50 mg组(4.00±0.53)分,F=0.18,P=0.84]、α-SMA评分降低[NS组(7.00±0.41)分,5 mg组(3.22±0.52)分,50 mg组(1.73±0.32)分,F=206.7,P<0.001],PCR检测结果显示肾组织Fyn mRNA相对表达量无明显变化[NS组(1.01±0.05)倍,5 mg组(1.00±0.07)倍,50 mg组(1.03±0.06)倍,F=0.14,P=0.87]、α-SMA相对表达量降低[NS组(1.00±0.02)倍,5 mg组(0.50±0.10)倍,50 mg组(0.24±0.04)倍,F=170.7,P<0.001],Western-blot检测结果显示肾组织Fyn表达水平无明显变化[NS组(0.36±0.04),5 mg组(0.37±0.07),50 mg组(0.32±0.06),F=0.78,P=0.48],α-SMA表达水平降低[NS组(1.27±0.15),5 mg组(0.70±0.08),50 mg组(0.15±0.04),F=149.6,P<0.001],均以50 mg组为著。结论RIF大鼠肾脏组织中wnt/β-catenin通路过度激活。AZD0530可通过阻止Fyn对β-catenin的磷酸化过程抑制wnt通路的激活,最终缓解肾间质的纤维化。

尿毒症患者血清通过ROS-NLRP3信号通路促进人主动脉平滑肌细胞增殖参与新生内膜增生

目的通过在体外模拟慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)病理环境探讨ROS-NLRP3信号通路在CKD中对血管新生内膜增生的影响。方法体外培养人主动脉平滑肌细胞(human aortic smooth muscle cells,HASMCs),实验分为3组:正常血清对照组(NC组)、尿毒症血清处理组(CKD组)、尿毒症血清+Mito-TEMPO处理组(CKD+Mito-TEMPO组)。采用Western blot、免疫荧光和ELISA实验方法观察尿毒症血清对HASMCs表型、氧化应激水平、炎症因子表达水平以及NLRP3炎症复合体表达的影响。结果与NC组相比,经尿毒症患者血清处理后,HASMCs增殖显著增强,平滑肌肌动蛋白α(smooth muscle actinα,α-SMA)和钙调理蛋白1的蛋白表达、线粒体活性氧(mitochondrial reactive oxygen species,mtROS)水平显著增加(P均<0.05),炎症因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-18和TNF-α的水平显著增加(P均<0.05),nod样受体蛋白3(nod-like receptor protein 3,NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)、剪切的caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表达水平显著增加(P均<0.05),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性降低显著降低(P<0.05);而加入mtROS抑制剂后,HASMCs增殖显著降低;α-SMA和钙调理蛋白1的蛋白表达,mtROS水平,炎症因子IL-6、IL-18、TNF-α水平,NLRP3、caspase-1、剪切的caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表达水平均显著减少(P均<0.05);SOD活性降低显著增加(P<0.05)。结论尿毒症血清通过ROS-NLRP3信号通路促进HASMCs增殖、参与新生内膜增生。

慢性肾衰竭幼鼠胫骨生长板软骨细胞初级纤毛高表达加速软骨细胞分化的机制研究

目的探讨慢性肾衰竭(chronic renal failure,CRF)幼鼠胫骨生长板软骨细胞初级纤毛高表达加速软骨细胞分化的机制。方法选取雄性4周龄SD大鼠40只,体重(98±3)g,随机分为对照组(蒸馏水,n=20)和CRF组(腺嘌呤150 mg·kg^(-1)·d^(-1),n=20),连续灌胃6周后处死幼鼠,采用胫骨制作组织学切片比较生长板长度,免疫荧光检测软骨细胞初级纤毛表达率、Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β联蛋白(β-catenin)表达水平;体外培养两组幼鼠胫骨生长板软骨细胞至第3代,免疫荧光检测软骨细胞初级纤毛表达率及印度刺猬蛋白(Indian hedgehog,IHH)和Wnt/β-catenin通路拮抗蛋白糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)表达水平;应用免疫共沉淀检测IHH与GSK3β之间的作用关系。结果与对照组相比,CRF组组织学切片生长板相对长度变短[(0.51±0.11)比(1.00±0.08),t=16.11,P<0.001],软骨细胞初级纤毛表达率增高[(26.3±5.5)%比(7.6±1.9)%,t=14.37,P<0.001],软骨细胞β-catenin蛋白表达增多[(7.1±2.0)分比(3.6±1.0)分,t=7.10,P<0.001]。体外培养结果显示,与对照组相比,CRF组软骨细胞初级纤毛表达率增高[(31.4±8.2)%比(12.5±3.1)%,t=9.64,P<0.001],IHH蛋白表达增多[(1360±270)比(310±84),t=16.61,P<0.001],而两组GSK3β蛋白表达差异无统计学意义[(850±195)比(780±140),t=1.30,P=0.200]。免疫共沉淀检测结果显示,CRF组GSK3β蛋白与IHH蛋白在软骨细胞内存在直接相互作用。结论CRF幼鼠胫骨生长板软骨细胞初级纤毛表达增多,相关蛋白IHH表达增多,IHH蛋白与Wnt/β-catenin信号通路拮抗蛋白GSK3β存在直接作用,导致Wnt/β-catenin信号通路激活、软骨细胞加速分化,最终导致生长板出现闭合趋势。

慢性肾衰竭幼鼠胫骨生长板软骨细胞线粒体自噬增强对软骨细胞凋亡的影响

目的探讨慢性肾衰竭(chronic renal failure, CRF)幼鼠胫骨生长板软骨细胞线粒体自噬水平及对细胞凋亡的影响。方法雄性4周龄Sprague-Dawley(SD)幼鼠40只, 按照随机数字表法分为正常对照组(蒸馏水灌胃)和CRF组(腺嘌呤150 mg·kg-1·d-1灌胃), 连续灌胃6周后处死幼鼠, X线测量胫骨长度, 组织学切片测量比较胫骨生长板宽度, 应用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测生长板软骨细胞凋亡率;体外培养正常对照组和CRF组幼鼠胫骨生长板软骨细胞至第3代, 应用TUNEL技术检测软骨细胞凋亡率, 应用荧光双染技术观测软骨细胞线粒体与自噬溶酶体共定位情况, 应用Western印迹法检测线粒体标志蛋白线粒体外膜转位酶(translocase of the outer mitochondrial membrane-20, Tom-20)和自噬标志轻链蛋白-3(light chain-3, LC-3)表达情况, 应用透射电镜观察软骨细胞线粒体自噬情况。结果与正常对照组相比, CRF组幼鼠胫骨长度较短[(27.32±5.81)mm比(35.43±3.61)mm, t=5.226, P<0.001], 生长板相对宽度较窄(0.56±0.19比1.00±0.21, t=6.744, P<0.001), 软骨细胞凋亡率较高(17.2%±4.8%比5.1%±3.4%, t=6.505, P<0.001)。CRF组体外培养生长板软骨细胞凋亡率高于正常对照组(11.8%±6.2%比3.1%±1.2%, t=4.357, P<0.001), 荧光双染技术结果显示CRF组软骨细胞线粒体与自噬溶酶体出现明显的共定位现象, CRF组软骨细胞LC-3蛋白(t=8.944, P<0.001)及Tom-20蛋白(t=6.708, P<0.001)表达均少于正常对照组, 电镜结果显示CRF组软骨细胞内出现较多的自噬囊泡吞噬线粒体并降解的现象。结论 CRF幼鼠胫骨生长板软骨细胞线粒体自噬水平出现增高现象, 导致线粒体减少, 引起软骨细胞凋亡、数量减少, 最终导致胫骨发育不良。

慢性肾功能不全幼鼠胫骨生长板软骨细胞糖原合成酶激酶3β表达水平变化对生长板发育的影响

目的观察慢性肾功能不全(chroic renal insufficiency,CRI)幼鼠胫骨生长板软骨细胞糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)表达水平变化对生长板发育的影响。方法将40只4周龄雄性SD幼鼠,按随机数字表法平均分为CRI组(腺嘌呤150 mg·kg^(-1)·d^(-1)灌胃,n=20)和对照组(同剂量蒸馏水灌胃,n=20),连续灌胃6周后处死全部幼鼠,取双侧胫骨制作组织学切片、番红固绿染色后比较两组幼鼠胫骨近端生长板宽度,应用免疫组织化学技术检测GSK3β表达部位及水平;提取两组胫骨生长板软骨细胞进行体外培养至第3代,观测软骨细胞内GSK3β、磷酸化GSK3β(p-GSK3β)、Wnt/β通路关键蛋白β联蛋白(β-catenin)、基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)表达水平,裂解细胞后应用蛋白质印迹法技术检测GSK3β、p-GSK3β、β-catenin、MMP-13表达水平。两组间比较采用成组t检验。结果幼鼠胫骨组织学切片显示CRI组生长板相对宽度为(0.52±0.14),对照组为(1.00±0.07),组间比较差异有统计学意义(P<0.001)。幼鼠胫骨组织学切片免疫组织化学结果显示CRI组软骨细胞GSK3β评分为(1.8±0.4)分,对照组为(7.1±2.2)分,组间差异有统计学意义(P<0.001)。体外细胞实验免疫组织化学结果显示CRI组软骨细胞内GSK3β评分为(0.94±0.32)分,对照组为(5.63±1.71)分,组间比较差异有统计学意义(P<0.001);CRI组p-GSK3β评分为(4.97±1.10)分,对照组为(1.58±0.51)分,组间比较差异有统计学意义(P<0.001);CRI组β-catenin评分为(5.11±2.03)分,对照组为(1.43±0.31)分,组间比较差异有统计学意义(P<0.001);CRI组MMP-13评分为(6.25±2.33)分,对照组为(2.57±1.13)分,组间比较差异有统计学意义(P<0.001)。蛋白质印迹法结果显示,CRI软骨细胞内GSK3β表达水平为(0.13±0.04),对照组为(0.38±0.11),组间比较差异有统计学意义(P<0.001);CRI软骨细胞内p-GSK3β表达水平为(0.52±0.18),对照组为(0.19±0.08),组间比较差异有统计学意义(P<0.001);CRI组软骨细胞内β-catenin表达水平为(1.03±0.21),对照组为(0.41±0.17),组间比较差异有统计学意义(P<0.001);CRI组软骨细胞内MMP-13表达水平为(0.56±0.18),对照组为(0.20±0.05),组间比较差异有统计学意义(P<0.001)。结论肾功能不全幼鼠胫骨生长板软骨细胞内GSK3β表达减少、其失活状态蛋白p-GSK3β表达明显增多,导致Wnt/β通路过度激活,生长板软骨细胞加速分化,生长板出现闭合趋势。