植物乳杆菌KF1对奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的抑菌机制

从开菲尔奶中筛选出一株具有强抑菌活性的乳酸菌KF1,经16S rDNA测序鉴定为植物乳杆菌。排除有机酸、过氧化氢的干扰试验,通过蛋白酶K和胰蛋白酶水解试验,证明该菌株产生的抑菌活性物质具有蛋白质性质,是一种细菌素。该细菌素在pH值2~4范围内抑菌效果稳定,当pH值达到8时,抑菌活性完全丧失;在121℃处理60 min后,仍保留约68%的活性,稳定性较好。抑菌谱试验表明,KF1细菌素对13株奶牛乳房炎病原菌都有不同程度的抑制作用,其中,对无乳链球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌等革兰氏阳性菌的抑菌作用最强,抑菌直径大于18 mm,抑制效果优于G―菌。通过研究KF1细菌素对菌体细胞壁、细胞膜通透性的影响,揭示其抑菌机制为膜孔道渗漏机制。另外,本文还发现KF1细菌素对多重耐药金黄色葡萄球菌生物被膜的形成―主要的毒力因子具有明显的抑制作用,显示其在奶牛乳房炎预防、治疗方面的应用前景。

牛源乳酸菌的粘附特性及对奶牛乳房炎大肠杆菌的粘附抑制研究

本文主要研究4株乳酸菌的粘附特性及对奶牛乳房炎大肠杆菌的粘附抑制作用。结果显示,分离自健康牛乳管中的乳酸乳球菌CM2和来源于奶牛肠道中的干酪乳杆菌CI2两株菌对Caco-2细胞及大鼠小肠黏液的粘附特性最强;在粘附与菌体表面性质的相关性试验中,测试菌株的粘附能力和疏水性具有良好的相关性,即疏水作用参与了菌株与Caco-2细胞的粘附。糖类抑制试验和酵母凝集试验表明CM2菌体表面分布着甘露糖特异性凝集素;通过各种化学和酶的处理及细胞壁表面成分的提取试验,揭示了CM2和CI2菌株粘附素的本质为蛋白质;另外,本文还研究了这两株乳酸菌对奶牛乳房炎致病菌大肠杆菌E1和E2的粘附抑制作用以及对Caco-2细胞的活性、分泌免疫相关细胞因子的影响,显示了其具有安全、天然、治疗奶牛乳腺炎的微生物制剂的开发潜力。

乳源凝固酶阴性葡萄球菌的PFGE分型及耐药性研究

对分离自隐性乳房炎乳样中的25株凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型，结果表明不同牛场流行的CNS种类和基因型有所不同，即使来自同一牛场的相同菌种也表现出完全不同的流行克隆型．证明了菌种基因型的多样性。MIC测定结果显示所有菌株都表现出三重以上耐药，且耐药程度高（36％～96％）。携带最多的耐药基因是ermC（96．55％）和tetK（89．66％）基因，然后是ermB（82．76％），tetM（82．76％），msrA（86．21％），msrB（82．76％）和lnuA（72．41％）基因，mph的基因含量最少，为41.38％。另外，本文还检测出4株恍cA基因阳性菌株，即超级耐药菌-MRCNS.MTP和刚果红试验结果显示88％的菌株都具有产生物被膜的能力。并且其多重耐药性显著高于不产生物被膜的菌株。综上所述，目前，乳源及食品动物源细菌耐药形式极其严峻，多重耐药菌及耐药基因的传播，给食品安全及公众健康造成了巨大风险，急需出台一系列的用药规定,加大科研力度，研究安全、绿色、高效新药物。

Nisin对奶牛乳腺炎葡萄球菌生物被膜形成的影响及调节机制

本文考察了nisinA对奶牛乳腺炎葡萄球菌生物被膜的形成及相关基因表达的影响。结果表明,亚抑菌浓度的nisinA对金黄色葡萄球菌SMS10和表皮葡萄球菌SMSE169的生长和生物被膜的形成都起到明显的抑制作用;当nisinA的浓度为8×MIC和16MIC时,其对菌株已形成的成熟生物被膜也具有良好的消除作用;采用电镜可以观察到经nisinA处理的生物被膜的密度和厚度显著降低,不仅出现了明显空隙,而且可见单个分散的菌体细胞。实时荧光定量PCR结果表明,相比于对照组,nisinA处理组的ica D,agr基因的表达显著提高,clfB基因的表达却显著下降,而关于RNAIII基因的表达情况,2株菌呈现出不同的变化趋势,显示出生物被膜基因调控的复杂性。nisinA天然、安全、高效等特点,将在奶牛乳房炎的预防和治疗上具有良好的开发前景。

乳酸菌抑制病原菌对奶牛乳腺上皮细胞的粘附和侵入作用

考察了分离自健康牛乳管中的乳酸乳球菌CM2和来源于奶牛肠道中的干酪乳杆菌CI2,对奶牛乳腺炎病原菌金黄色葡萄球菌SMS81和大肠杆菌SME177的粘附侵入乳腺上皮细胞的抑制作用;研究了菌体细胞侵入乳腺上皮细胞后相关抗菌肽表达的情况。结果表明:两株乳酸菌CM2和CI2具有显著抑制病原菌粘附和侵入b MEC的能力,并且具有一定的浓度依赖性;加热灭活处理的乳酸菌仍然具有抑制病原菌粘附b MEC的能力,但抑制侵入的能力严格依赖于菌体细胞的活性;乳酸菌细胞培养上清液还可以降低病原菌对b MEC细胞的粘附能力,这可能与乳酸菌产生细菌素有关。实时荧光定量PCR结果显示:CM2菌株显著提高了金黄色葡萄球菌SMS81和大肠杆菌SME177侵入b MEC后抗菌肽TAP和BNBD10基因的表达水平,推测可能与乳酸菌抑制病原菌侵入内化牛乳腺上皮细胞有关。本研究成果为奶牛乳腺炎天然、安全、无污染的有效治疗提供了新的开发前景。