组织因子人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建组织因子人-鼠嵌合抗体的真核共表达载体pCN40-VL-VH,并转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中进行稳定表达,以克服鼠源单克隆抗体(mAb)用于临床的局限性。方法:从分泌鼠抗人的组织因子mAb的杂交瘤细胞株(克隆号:mTA)中抽提总RNA,经RT-PCR扩增mAb VL和VH的基因序列,构建重组真核表达载体pCN40-VL-VH,并进行酶切鉴定和测序。通过磷酸钙沉淀法转染CHO细胞,以终浓度800μg/LG418筛选阳性细胞,通过间接ELISA、Western blot检测细胞培养上清中嵌合抗体的表达量、活性及特异性。结果:成功构建了抗人组织因子嵌合抗体真核共表达载体pCN40-VL-VH并在CHO细胞中表达。ELISA、Western blot证实,表达的抗组织因子嵌合抗体为人鼠嵌合抗体,该抗体能与重组人TF抗原特异性的结合且表达量为51.25mg/L。结论:成功地构建并在真核细胞中表达了抗人组织因子嵌合抗体,为进一步的研究奠定了基础。

Wnt信号通路调控肠癌细胞GRP78表达与细胞膜转位

目的本研究旨在探讨Wnt/β-catenin信号通路和葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)两者在肠癌细胞中的调控关系。方法本研究采用氯化锂(LiCl)处理肠癌HT-29和DLD1细胞,激活其Wnt/β-catenin信号通路。通过Western blot和荧光定量PCR,检测Wnt信号活化对GRP78表达的影响;通过对细胞组分的分离和免疫荧光染色技术分析Wnt信号活化对GRP78细胞膜转运的影响。结果 LiCl处理能够显著激活HT-29和DLD1细胞中的Wnt/β-catenin信号通路,GRP78蛋白在HT-29细胞膜表面呈独特的"簇状"分布,LiCl处理明显提高了细胞中GRP78的转录和翻译水平,且GRP78在细胞表面的分布水平也有明显增加。结论肠癌细胞中GRP78的表达和细胞膜转位受Wnt/β-catenin信号通路活性的调控。

具有抗凝活性抗人组织因子单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备并鉴定具有抗凝血活性的抗人组织因子(h TF)单克隆抗体(m Ab)。方法以截短型重组h TF243蛋白免疫BALB/c小鼠,细胞融合后,采用间接ELISA联合血浆凝血酶原时间(PT)测定方法,筛选具有抗凝血活性的抗h TF m Ab的杂交瘤细胞株,并进行效价测定和特异性鉴定。结果成功建立1株可稳定分泌具有抗凝血活性的抗h TF m Ab的杂交瘤细胞株,该m Ab属于Ig G1亚型。间接ELISA测定腹水效价为1∶200 000,Western blot、PT测定结果表明,该m Ab可特异性结合重组h TF243,同时与SW620结肠癌细胞表面天然TF作用,显著延长血浆凝血酶原时间,具有良好的抗凝血活性。结论成功制备了具有抗凝血活性的抗h TF m Ab。

人自分泌运动因子哺乳细胞表达纯化及酶学特性

[目的]利用哺乳细胞表达系统表达人ATX蛋白,并对其进行纯化、酶学性质分析。[方法]以pFastBacTMHTAATX质粒为模板,PCR扩增ATX基因,并连接至质粒pInsulator-8His,构建真核表达质粒pInsulator-ATX-8His,经双酶切鉴定后,并瞬时转染至HEK293F细胞,SDS-PAGE检测ATX的表达。通过Ni柱和凝胶层析两步法纯化ATX,HPLC鉴定ATX蛋白的纯度。利用Bis-pNPP底物检测纯化ATX的活性及酶学性质。[结果]真核表达质粒pInsulator-ATX-8His构建成功,并在HEK293F细胞中成功表达,经纯化后ATX蛋白纯度达到98%,并且纯化的ATX具有磷酸二酯酶的活性。酶学性质分析,该酶反应最适pH值为9.0,在0~50℃有较好的热稳定性,金属螯合剂EDTA可抑制ATX活性,金属离子Ca^(2+)、Mg^(2+)、Zn^(2+)促进ATX的活性。[结论]实现了人ATX在哺乳细胞中的表达,获得了高纯度的ATX蛋白,完成了ATX酶学性质的分析。