磁性分离法高效快速培养原代C57BL/6J小鼠眼动脉平滑肌细胞

目的建立一种高效、快速地培养原代C57BL/6J小鼠眼动脉平滑肌细胞(OASMC)的磁性分离法。方法综合组织块贴壁法和酶消化法2种方法,通过优化胶原蛋白酶、琼脂糖氧化铁(Ⅱ,Ⅲ)磁性纳米粉末(以下简称铁粉)配方和铁粉粒径等关键实验环节,培养高纯度OASMC。原代OASMC培养和鉴定步骤:在无菌条件下,向小鼠左心室依次注入4℃PBS、琼脂糖铁粉混悬液,在解剖显微镜下分离出眼动脉。将其划至长为1.0~1.5 mm大小的组织块,用胶原蛋白酶消化45 min后,采用磁力分离器将眼动脉组织块从胶原蛋白酶中分离出来,均匀接种于培养皿中,置于37℃、5%CO_(2)条件下培养,待细胞生长至85%~90%时进行传代。对第3~7代细胞进行形态学及免疫荧光染色鉴定。结果通过改变不同条件确定了最佳实验条件:胶原蛋白酶与M199培养基比例为0.0015 g∶6 mL,胶原蛋白酶消化时间为45 min,铁粉粒径为5μm,琼脂糖与铁粉的比例为0.05 g∶0.05 g;琼脂糖铁粉混悬液的温度为37℃,注射器型号为0.6 mm×25 mm TWLB。原代培养2 d后可见眼动脉组织块周围有长梭形细胞爬出,呈放射状分布。培养7 d后,通过更换新的培养基铁粉逐渐减少,细胞生长速度加快,细胞形态呈现典型长梭形。免疫荧光染色结果显示所培养的OASMC表达α-平滑肌肌动蛋白。结论此方法培养原代C57BL/6J小鼠OASMC具有快速、高效、细胞纯度高等特点,为眼动脉相关疾病的药物活性筛选奠定了基础。