重组人生存素单体分子与双体分子的原核表达研究

目的重组并高效表达人生存素单体分子和双体分子。方法PCR扩增人生存素基因,将其单一读码框和双读码框重组到原核表达质粒载体pKpL5的表达框内,限制性内切酶分析后,于42℃诱导表达,并以SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达结果。结果经限制性核酸内切酶分析,表达重组人生存素单体分子质粒pKpL5-sSURVIVIN和表达人生存素同源双体分子质粒pKpL5-dSURVIVIN均正确构建,可高效表达分子量约18.5KDa的人生存素单体分子与分子量约35KDa的同源双体分子,所表达的目的蛋白可被抗人生存素的多克隆抗体特异性识别。结论该研究成功高效表达人生存素单体分子与同源双体分子,为进一步研究其生物活性与免疫原性奠定了物质基础。

鲍曼不动杆菌三价抗原融合蛋白的制备及其免疫原性研究

目的制备鲍曼不动杆菌SmpA/Omp22/NlpA(1⁃128)三价抗原融合蛋白,免疫接种Balb/c小鼠后探究其免疫原性。方法通过人工合成结合PCR扩增法获取smpA/omp22/nlpA(1⁃384)融合基因,将该融合基因克隆到质粒载体pColdI中,构建重组质粒pColdI⁃SON。将该重组质粒转化E.coli BL21进行原核表达,并将纯化的重组蛋白与弗氏佐剂混合作为免疫原经背部皮下注射接种Balb/c小鼠,并于初次接种后第14、28天各加强免疫1次,同时设置佐剂对照组和PBS对照组。分别于末次免疫后第7、21天小鼠内眦取血分离血清,ELISA检测抗体滴度。分离免疫小鼠脾淋巴细胞,检测抗原刺激培养后脾细胞增殖活性及IFN⁃γ/IL⁃4的分泌情况。结果所构建的重组质粒大小约为5.9 kb,转化大肠杆菌后诱导表达并纯化出分子量约56 kDa的重组蛋白,免疫接种后在小鼠体内检测到高滴度的抗原特异性IgG抗体,小鼠脾淋巴细胞增殖活性明显高于佐剂及PBS对照组(P<0.001),免疫小鼠脾淋巴细胞经抗原刺激后所产生的IL⁃4水平明显高于对照组(P<0.01),而IFN⁃γ产生水平各组间无显著性差异。结论成功制备了鲍曼不动杆菌SmpA/Omp22/NlpA(1⁃128)融合蛋白,小鼠免疫接种后显示出较强免疫原性。

猪苓多糖对脐血造血干细胞体外扩增及干细胞移植后免疫重建的调节效应

目的:人脐血造血干细胞得以移植于小鼠体内,其理论基础是放射线照射使小鼠骨髓枯竭,龛位腾出,为移植的脐血造血干细胞提供空间,而猪苓多糖是从中药猪苓中提取的多糖成分,具有免疫调节抗肿瘤作用,也是一种非T细胞促有丝分裂素,对放射线照射有一定的防护作用。观察猪苓多糖对脐血造血干细胞体外扩增及干细胞移植后免疫重建效应。方法:实验于2004-06/2006-05在兰州大学基础医学院免疫研究所完成。①实验材料:清洁级BALB/c小鼠由兰州生物制品研究所提供,8周龄,体质量约20g,雌雄各半,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。脐血样本由兰泰医院妇产科提供,产妇及家属对实验知情同意,并经医院伦理委员会批准。猪苓多糖由兰州大学第一医院提供。②实验方法:应用20,17.5,12.5,7.5mg/L猪苓多糖体外扩增培养脐血造血干细胞,并测定细胞增殖率及CD34+细胞数。将BALB/c小鼠分为正常对照组:尾静脉、腹腔注射等量生理盐水;照射空白组:3.5Gy经^(60)Coγ放射线照射联合尾静脉、腹腔注射等量生理盐水;照射药物组:3.5Gy经^(60)Coγ放射线照射联合尾静脉注射等量生理盐水、腹腔注射猪苓多糖;照射移植组(n=15):3.5Gy经^(60)Coγ放射线照射联合脐血造血干细胞移植、腹腔注射等量生理盐水;照射移植药物组:3.5Gy经^(60)Coγ放射线照射联合脐血造血干细胞移植、腹腔注射猪苓多糖。③实验评估:观察小鼠生存状况及血常规变化,流式细胞仪测定CD3、CD4、CD8、CD19水平。结果:57只小鼠均进入结果分析。①12.5mg/L猪苓多糖增殖效率最为显著(P<0.01),流式细胞仪测定显示CD34+细胞数扩增了6.33倍。移植药物组小鼠死亡率最低,死亡高峰集中在照射移植后7~14d左右。②移植药物组小鼠血象恢复正常,并且时间明显短于其他实验组(P<0.05)。③细胞及体液免疫恢复情况,移植药物组小鼠各项指标水平与正常小鼠无差别(P>0.05),与其他各组小鼠比较,除CD4、CD19水平与照射移植小鼠无差别外均有差别(P<0.05)。结论:猪苓多糖对脐血造血干细胞有明显扩增作用,并能促进脐血造血干细胞移植小鼠免疫造血重建。

FTY720诱导1型1-磷酸鞘氨醇受体内化与其保守基序的关系研究

目的:研究FTY720诱导1型1-磷酸鞘氨醇受体(S1P1)内化与后者保守基序之间的关系。方法:以HA-S1P1(WT)-Myc-EGFP-N1融合表达载体为模板,应用重叠PCR的方法,将S1P1保守基序ERY突变为ENY,构建HA-S1P1(R142N)-Myc-EGFP-N1融合表达载体。测序鉴定后,经Polyfect转染入HEK293细胞。G418筛选出稳定细胞株。100 nmol/LFTY720处理3、6、12小时后,荧光显微镜下观察S1P1在HEK293细胞上的表达情况。结果:HA-S1P1(R142N)-Myc-EGFP-N1载体被成功构建,S1P1(WT)和S1P1(R142N)蛋白表达在HEK293稳定细胞株的表面,FTY720能诱导S1P1(WT)内化,但不能诱导S1P1(R142N)内化。结论:FTY720诱导S1P1内化与ERY保守基序有关。

不同种株利什曼原虫对Balb/c小鼠和金黄地鼠的致病性研究

为了比较不同种株利什曼原虫对实验动物的致病性,分别将5×107的杜氏利什曼原虫SC6株、热带利什曼原虫K27株、婴儿利什曼原虫LEM235株和婴儿利什曼原虫KXG-Liu株前鞭毛体与无鞭毛体感染Balb/c小鼠和金黄地鼠,观察各感染动物皮肤损害状况,3月后,有限稀释培养法分别检测肝和脾脏内的虫荷数。发现不同种株利什曼原虫引起的疾病存在极大的异质性,杜氏利什曼原虫四川SC6株致Balb/c小鼠轻微皮肤损害,肝和脾脏内重度虫荷数,金黄地鼠肝和脾脏内重度虫荷数;热带利什曼原虫K27株致Balb/c小鼠严重的皮肤损害,但肝和脾脏的虫荷数较低,金黄地鼠肝和脾脏中未查见原虫;婴儿利什曼原虫LEM235株致Balb/c小鼠严重的皮肤损害,肝和脾脏内重度虫荷数,金黄地鼠肝和脾脏内重度虫荷数;婴儿利什曼原虫KXG-Liu株可致Balb/c小鼠严重的皮肤损害,肝和脾脏中度虫荷数,金黄地鼠肝和脾脏内少量虫荷数。另外,还发现原虫的生活史状态和进入机体的途径及实验动物的类型对不同种株利什曼原虫感染致病产生影响。

早期糖尿病大鼠视网膜蛋白质表达变化的初步研究

目的观察2个月病程大鼠视网膜组织蛋白质变化情况;建立并优化视网膜蛋白质组分析所需要的双向凝胶电泳(2-DE)技术,提高其分辨率及重复性。方法提取视网膜蛋白质进行2-DE,对影响2-DE结果的各种因素进行调整、优化。用PDQUest7.3.2软件分析凝胶图谱以获得差异表达的蛋白点。结果成功获得了视网膜组织的2-DE图谱。比较后得到36个表达差异有统计学意义(P<0.05)的蛋白质点,包括上调5个,下调23个,消失8个。结论2个月病程糖尿病大鼠视网膜已经有蛋白质表达的差异。已建立的视网膜蛋白质2-DE技术将为进一步开展视网膜疾病的蛋白质组学研究奠定基础。

不同种株利什曼原虫前鞭毛体体外向无鞭毛体转化的研究

目的观察不同种株利什曼原虫前鞭毛体在不同体外培养条件下向无鞭毛体的转化。方法将6个对数生长期的不同种株利什曼原虫前鞭毛体接种于含M199和RPMI1640复合培养液的24孔板内,在不同温度、pH值、血清、CO2下培养,第3天和第6天分类计数不同形态的原虫。结果当培养温度为26℃,而其他培养条件发生变化时,利什曼原虫的增殖速度发生变化,大多数原虫保持前鞭毛体典型性形态,运动活跃。当培养温度上升至37℃,不论其他培养条件如何变化,原虫均沉积于培养孔底,停止增殖,运动减缓,显著地向中间体和无鞭毛体转化,酸性pH值和5%CO2可促进前鞭毛体转化为无鞭毛体,新生小牛血清可延长无鞭毛体的成活。但相同的培养条件下,杜氏利什曼原虫转化效率低于其他种株利什曼原虫。结论温度是影响利什曼原虫前鞭毛体转化为无鞭毛体的基本因素,酸性pH值与CO2可协同温度促进转化,不同种株利什曼原虫的遗传异质性可影响转化效率。

干细胞因子研究进展

人干细胞因子(hSCF)是新近发现的重要造血细胞因子,它是酪氨酸激酶受体c-K it的配体。SCF主要作用于早期造血干细胞、原始造血祖细胞,并且诱导这些细胞的存活、增殖和分化。SCF单独使用生物学作用低,但它与其它细胞因子具有强的协同作用。SCF临床应用,包括体内干细胞扩增治疗、用于基因治疗的体外培养造血干细胞及肿瘤放疗化疗后的辅助治疗。SCF与G-CSF联合使用刺激扩增外周血干/祖细胞(PBPCs),可用于干/祖细胞移植,以增加患者所需PBPCs的比例,减少收集PBPCs的次数。本综述主要介绍了人SCF的发现、结构、功能及临床应用。

S1P1受体细胞模型的构建及其功能特性的初步研究

目的构建1型1-磷酸鞘氨醇受体(S1P1)的细胞模型,初步探讨其介导的功能特性。方法用PolyFect,将包含全长人S1P1编码区与EGFP融合基因的载体HA-S1P1-Myc-EGFP-N1转入CHO细胞,经G418筛选,获得S1P1-EGFP-CHO稳定细胞株。以空载体pEGFP-N1转染的CHO稳定细胞株作为阴性对照,镜下观察细胞的形态。100nM FTY720处理S1P1-EGFP-CHO细胞5、24小时后用荧光显微镜观察S1P1在细胞上的表达。结果成功构建S1P1-EGFP-CHO细胞模型,表达S1P1的细胞变圆,FTY720导致该细胞模型的S1P1长时间内化。结论S1P1-EGFP-CHO细胞可作为S1P1功能特性研究的细胞模型,S1P1能使细胞变圆,FTY720能导致S1P1长时间内化。

乙型肝炎病毒前S2/S与重组人GM-CSF融合基因的分子克隆及鉴定

目的 为探讨乙型肝炎病毒前S2 (preS2 )和粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子(GM -CSF)对乙型肝炎疫苗的免疫增强作用,构建S2 /S(preS2 +HBsAg)与GM -CSF融合基因真核表达载体。方法 采用PCR技术分别扩增出S2 /S大小约846bp的编码基因片段和带有15个甘氨酸接头序列的GM CSF约45 0bp编码基因片段,经T A克隆后分布克隆至载体PcDNA3 .1中,获得PcDNA3 .1 S2 /S GM CSF融合基因表达载体,利用酶切、PCR和DNA序列测定进行鉴定插入片段的大小和方向。结果 经过鉴定该融合基因全长约13 0 0bp ,证实为S2 /S GM- CSF融合基因。结论 乙型肝炎病毒(HBV)S2 /S和GM- CSF融合基因真核表达载体构建成功,为进一步研究其表达和生物学活性奠定了一定基础。

川北地区胃癌差异表达基因的筛选

目的比较胃癌组织和癌旁正常黏膜组织之间基因表达差异,筛选胃癌特有的差异表达基因片段,为揭示胃癌的病因提供实验室依据。方法运用抑制消减杂交技术(SSH),构建胃低分化腺癌组织cDNA消减文库,采用RT-PCR技术对5例不同阶段胃癌患者的癌组织及癌旁正常黏膜组织相应基因进行筛选。结果成功构建胃低分化腺癌cDNA消减文库,获得5个特异性序列标签(NBPF1、FAM48A、RXFP2、ACTB和QDPR),通过RT-PCR技术进行筛选,获得RXFP2基因的mRNA在所取标本中的差异表达。结论筛选得到胃癌特异性表达基因RXFP2,对了解胃癌发生发展的病因学基础和指导临床治疗具有重要意义。

基因组免疫系统

随着对RNAi现象及其功能的深入研究 ,揭示dsRNA/siRNA具靶向降解特异性mRNA、抑制相应基因表达作用 ,有抵抗病毒和转座子入侵基因组的重要功能 ,故被称为“基因组免疫系统”。本文综述了该系统的发现、功能、作用机制和应用前景。

南充地区汉族群体15个STR基因座遗传多态性研究

目的获取15个短串联重复序列（STR）基因座在四川南充地区汉族人群的群体遗传学数据。方法160份EDTA抗凝血样采自南充地区无血缘关系的汉族个体。Chelex法提取DNA，AmpFISTR IdentifilerTM kit荧光标记试剂盒进行复合扩增，自动基因分析仪电泳并收集电泳结果数据，基因扫描分析软件计算扩增产物片段相对大小，基因分型软件进行样本基因型分型。结果在南充地区汉族人群160名无血缘关系的个体中共检出140个等位基因，其频率分布介于0．004～0．528之间。15个STR基因座的杂合度介于0．151～0．905之间，累积个人识别率和累积非父排除率分别达到0．999998和0．999999。结论该15个STR基因座具有高度多态性，是较理想的遗传标记，所得到的等位基因频率等数据可为南充地区汉族人群的法医学个人识别、亲子鉴定及群体遗传学研究提供基础依据。

用bcl-2反义mRNA和dsRNA抑制SP_2/O生长的比较研究

目的 本研究旨在比较靶向bcl- 2基因的反义mRNA和dsRNA对SP2 O细胞生长的抑制作用。方法 采用MTT法,免疫荧光和免疫细胞化学技术,克隆形成试验及分光光度计测定细胞总蛋白含量等方法,分析比较了经体外转录获得的bcl- 2反义mRNA利LdsRNA抑制SP2 O细胞生长、bcl- 2特异性蛋白和总蛋白表达及其克隆原性的作用。结果 检测结果证实bcl- 2反义mRNA和dsRNA对上述指标均有抑制作用,两者比较dsRNA的抑制作用更强,持续时间也较长,作为对照的bcl- 2正义RNA对上述指标无显著增强作用。提示LdsRNA对bcl- 2高表达的肿瘤细胞有更强的抑制和杀伤作用,因此有可能用于这些肿瘤的临床治疗。

RNAi抑制胰腺癌细胞survivin表达的实验研究

目的用RNA i方法抑制胰腺癌细胞PANC-1中凋亡抑制蛋白survivin的表达。方法用免疫细胞化学技术和RT-PCR检测胰腺癌细胞PANC-1中凋亡抑制蛋白survivin的表达,构建针对survivin基因的siRNA表达载体并进行酶切和测序鉴定,用脂质体转染胰腺癌细胞PANC-1,RT-PCR初步分析siRNA表达载体对survivin表达的抑制作用。结果survivin在胰腺癌细胞PANC-1中有较高表达,siRNA表达载体可以有效的抑制survivin的表达,抑制率达60%。结论用RNAi表达载体可以有效抑制胰腺癌细胞PANC-1中凋亡抑制蛋白survivin的表达。

杜氏利什曼原虫表达位点相关基因样蛋白的分子克隆及表达定位

目的克隆杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)无鞭毛体特异表达新基因,观察其编码蛋白的亚细胞定位。方法制备杜氏利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体m RNA,以消减抑制杂交技术筛选无鞭毛体新的表达序列标签,扩增含有新表达序列标签的基因全长c DNA,Northen杂交和RT-PCR检测新基因在前鞭毛体和无鞭毛体中的表达,共表达方法观察杜氏利什曼原虫内新基因编码蛋白的亚细胞定位。结果构建了杜氏利什曼原虫无鞭毛体表达序列标签消减文库,克隆到一个新基因,命名为表达位点相关基因样蛋白(ESAGLP)基因,其c DNA全长为2 258 bp,编码620 aa。ESAGLP基因仅在无鞭毛体内表达,其编码蛋白定位于线粒体。结论 ESAGLP鉴定为杜氏利什曼原虫无鞭毛体新基因,其编码蛋白定位于无鞭毛体的线粒体。

利什曼原虫减毒活疫苗研究进展

利什曼原虫减毒活疫苗因其保留了大部分免疫原性,能感染巨噬细胞,诱发与自然感染类似的免疫应答而受到众多科学家的青睐。本文综述了近年来减毒活疫苗的研究进展。

婴儿利什曼原虫细胞免疫优势抗原预测

目的:预测婴儿利什曼原虫全基因组编码蛋白中刺激细胞免疫应答的优势抗原。方法:以计算机软件Net CTLpan对婴儿利什曼原虫基因组编码蛋白进行分析,确定与各类人HLA I类分子超型强结合抗原蛋白,综合预测细胞免疫优势抗原。结果:84个婴儿利什曼原虫基因组编码蛋白可与人HLA A2超型强结合,其中13个蛋白质还可与人HLA A1、A3、A26、B44、B7、B8、B58、B62、B39及B27超型强结合,它们大多数为膜蛋白,具有种属特异性。结论:预测婴儿利什曼原虫优势抗原可为发展抗内脏利什曼病疫苗提供新的视角。

人胰腺癌组织的差异蛋白质组学研究

目的探讨胰腺癌的发病机制,寻找与临床诊断及治疗相关的生物学标记或靶标。方法采用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-DE)技术对5例人胰腺癌组织及其癌旁组织的总蛋白进行分离,PDQuest 7.0软件分析获得差异蛋白质点,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对蛋白质点进行鉴定,采用免疫组化染色进一步验证差异表达蛋白。结果共获得10个差异表达蛋白质点。质谱鉴定结果显示,尼克酰胺N-甲基转移酶(NNMT)和铁蛋白在胰腺癌组织中表达明显高于其在癌旁组织中表达(>4倍),而谷胱甘肽S-转移酶、DNA拓扑异构酶、T细胞受体β-链、IKK抑制因子ε1、转胶蛋白、二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1(DDAH1)、半乳糖激酶1、肌球蛋白等在胰腺癌癌旁组织中表达明显高于其在癌组织中表达(>4倍)。免疫组化结果显示,铁蛋白在胰腺癌组织中表达高于癌旁组织,DNA拓扑异构酶、谷胱甘肽S-转移酶、肌球蛋白在癌旁组织中表达高于癌组织。结论以2-DE和MALDI-TOF-MS为基础的蛋白质组学技术是研究肿瘤的一种重要手段,实验得到的差异蛋白可能是潜在诊断胰腺癌的分子标志或控制肿瘤生长的治疗靶点。

南充地区不同叶型半夏的指纹图谱分析

目的:比较南充地区野生芍药叶型和竹叶型半夏的指纹图谱并鉴定差异分子。方法:采用RAPD扩增、分析不同叶型半夏指纹图谱,并对典型特异扩增条带进行克隆和测序分析。结果:36条随机引物中有22条扩增出清晰条带。芍药叶型半夏基因组DNA扩增出157条带,竹叶型半夏基因组DNA扩增出161条带。芍药叶型半夏基因组DNA扩增的差异带3条,竹叶型半夏基因组DNA扩增的差异带7条。差异条带AOPN-14300经克隆测序证实为非编码区序列,Genbank登记号为EF417577。结论:南充野生不同叶型半夏基因组存在差异,已将部分典型差异基因组DNA片段进行克隆,为从分子水平鉴别本地区半夏奠定基础。