紫外线致Hep-G2细胞调亡的分子机制初探

紫外线 (UV)是人类最常接触的具基因毒作用的因子。为探索紫外线辐射致细胞凋亡和组织损伤的分子机制 ,本研究采用免疫细胞化学技术与特异性抗体初步探索了经紫外线辐射处理的Hep G2细胞P5 3、Caspase3、bcl 2和P2 1等与细胞凋亡和生长抑制基因的表达情况。结果表明经紫外线辐射处理的Hep G2细胞的P5 3、Caspase3和bcl 2基因表达增加 ,而P2 1未见明显改变 ,提示P5 3、Caspase基因在紫外线辐射诱导的细胞凋亡中起重要作用 ,bcl 2增高可能有抑制细胞的过度凋亡 ,保持内在平衡的作用。P2 1保持不变或下降可能反映了细胞对DNA损伤应答的新途径。

H_2O_2致Hep-G2细胞凋亡及其分子机制初探

目的本研究旨在探索H2O2 诱导Hep-G2发生凋亡及其致凋亡发生的分子机制。方法采用免疫细胞化学技术与特异性抗体初步探索了经H2O2 处理的Hep-G2细胞Fas、bcl-2、P53、P21、Caspase3等与细胞凋亡和生长抑制基因的表达情况。结果检测结果表明H2O2 处理的Hep-G2细胞的Fas和Caspase3基因表达增加, bcl-2基因表达减少,而P53、P21基因的表达未见明显改变,提示Fas、Caspase3和bcl-2基因在H2O2 诱导的细胞凋亡中起重要作用;bcl-2通过抑制诱导凋亡所致的细胞永生化,可能在肿瘤的发生、发展中起重要作用。P53、P21、保持不变,可能反映了H2O2 诱导的细胞凋亡不依赖P53途径。

靶向HBs基因的shRNA表达载体的构建及其抑制HepG2.2.15表达HBVsAg的作用

探索用PGenesil-1(Pg)构建的靶向乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的shRNA表达载体PGenesil-1-HBs(简称Pgs),对体外培养HepG2.2.15细胞中的HBV基因及其抗原表达的抑制作用。设计、合成靶向HBVS区的3对DNA序列,分别插入PGenesil-1中构建3个siRNA表达载体Pgs1、Pgs2、Pgs3,经限制性内切酶,DNA序列测定等技术鉴定确认。筛选并确定最佳细胞接种量及重组质粒转染量后,分别或按不同组合转染HepG-2.2.15细胞,48h后采用半定量RT-PCR检测HBVsmRNA转录水平,免疫细胞化学技术检测HBsAg表达水平,MEIA分别检测细胞裂解液和培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平。结果表明,HBV真核表达载体Pgs1、Pgs2、Pgs3均能不同程度地抑制HepG2.2.15细胞中的HBsAg、HBeAg合成和HBs-mRNA转录。成功构建的HBV真核表达载体Pgs1、Pgs2、Pgs3,其中PgS3能显著抑制HBsAg表达(P<0.01)。多种表达载体联合对抗原表达的抑制作用效率不同。

针对HBs基因的shRNA表达载体的构建及鉴定

目的以PGenesil-1(Pg)为载体构建针对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的shRNA表达载体PGenesil-1-HBs(Pgs)。方法设计、合成针对HBs区的三对DNA序列,分别插入PGenesil-1中,并对重组质粒进行限制性内切酶谱和DNA序列测定分析。结果3个不同的重组shRNA表达载体经限制性酶识别和DNA序列测定完全正确。结论成功构建了3个针对HBs基因的shRNA表达载体。

限制片段差异显示聚合酶链反应建立人类疾病表达谱的研究(英文)

目的用限制片段差异显示聚合酶链反应(restrictionfragmentdifferentialdisplaypolymerasechainreaction,RFDDPCR)技术建立基因表达谱,分析比较人类疾病表达谱差异的可行性。方法采集乳腺癌根治术患者的乳腺癌组织、乳腺癌转移淋巴结及正常乳腺组织,用RFDDPCR技术平行操作,获得3种组织全部转录物组片段。然后以7%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表达差异基因片段的分离、显示,结合http://www.Qbiogene.com/display/数据库资料,进行生物信息学分析,初步筛选各组织间有表达差异的基因。结果建立了乳腺癌组织、乳腺癌转移淋巴结及正常乳腺组织的基因表达谱,获得基因片段5407个,其中在癌组织和正常组织间有表达差异的片段为1491个,癌组织与转移淋巴结间的差异片段有1176个,而转移淋巴结与正常组织间的差异片段为1462个,分别占表达数的40.9%,33.9%,39.6%。这些差异片段涉及细胞增殖分化,信号转导,炎性反应,肿瘤转移等多方面功能。结论RFDDPCR技术可以检测出大量表达基因,并同时比较3种或3种以上样本的表达差异,适用于人类疾病差异表达谱分析,筛选出疾病的候选基因。同时,还有可能找到新基因或新表达序列标签。

糖尿病大鼠视网膜基因表达谱差异的初步分析

目的建立大鼠正常视网膜和糖尿病8周视网膜基因表达谱,比较两者差异,初步分析糖尿病视网膜病变的相关基因。方法通过限制片段差异显示PCR(restriction fragments differential display-PCR,RFDD-PCR)获得正常大鼠视网膜及8周糖尿病大鼠视网膜组织转录组片段。应用Fragment Analysis等软件,对差异片段进行生物信息学分析,初步确定糖尿病视网膜病变相关基因/表达序列标签(expression se-quence tag,EST)。结果获得有意义的片段共3639个,有差异的片段840个,占表达数的23.08%。其中包括5个视觉传导相关基因,13个兴奋性神经递质受体基因和3个抑制性神经递质受体基因。糖尿病8周大鼠视网膜Rhodopsin kinase、β-arrestin、Phosducin、rod photoreceptor cGMP-gated channel和Rpe65的表达下调,离子型谷氨酸受体iGluR1-4下调,代谢性谷氨酸受体及γ-氨基丁酸受体各亚型则普遍上调,而甘氨酸受体表达无变化。结论糖尿病8周大鼠神经视网膜已受到累及,其基因表达模式的改变,可能与糖尿病早期视功能损害有关。

鲍曼不动杆菌OmpK/Omp22融合蛋白的制备及诱导小鼠抗体应答水平检测

目的制备鲍曼不动杆菌OmpK/Omp22融合蛋白,并检测其抗原特异性抗体应答水平。方法以鲍曼不动杆菌标准株19606基因组DNA为模板,通过重叠延伸PCR技术获取OmpK/Omp22融合基因片段,将其定向克隆入原核表达质粒pColdI,筛选重组质粒并进行酶切及DNA测序鉴定。重组质粒转化大肠埃希菌BL21株,经IPTG诱导表达,镍亲和纯化柱纯化重组蛋白。小鼠背部皮下注射重组融合蛋白(20μg/只,体积50μL)和等体积完全弗氏佐剂,并于初次免疫后第14和21天相同剂量加强免疫1次,分别于末次免疫后7、21 d小鼠内眦取血,测定小鼠血清中抗原特异性抗体滴度。结果 PCR扩增获得约1 400 bp的基因片段,定向克隆筛选到约5 800 bp的重组质粒,纯化的重组融合蛋白相对分子质量约52 000,小鼠血清中检测到特异性IgG抗体,最高抗体滴度可达1∶102 400。结论成功制备了鲍曼不动杆菌OmpK/Omp22融合蛋白,小鼠血清中检测到高滴度特异性IgG抗体,为进一步研究其免疫活性奠定了基础。