RNA干扰技术在肿瘤基因治疗中的研究现状

RNA干扰（RNAinterference，RNAi）技术是利用双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA），高效、特异性降解细胞内同源信使RNA（messengerRNA，mRNA），从而阻断特定基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。1998年Fire等[1]首次应用RNAi技术将dsRNA正义链与反义链的混合物注入线虫体内，结果发现注入dsRNA比单独注入单链RNA引起的基因沉默要强得多，并可导致子一代同源基因的沉默。

黄芪总黄酮对辐射损伤小鼠的防护作用研究

目的:研究黄芪总黄酮(Total flavonoids of astragalus,TFA)对受60Coγ射线损伤小鼠的辐射防护作用,为TFA的临床应用提供实验依据。方法:采用大剂量60Coγ射线一次性全身照射雌性昆明小鼠,制成放射损伤动物模型。小鼠在照射前3d及照射后,以不同剂量的TFA连续灌胃14d,观察受致死剂量60Coγ射线照射小鼠的30d存活率及生存时间长短。同时,在低剂量照射组检测用药后小鼠体重、外周血指标、脾脏指数的变化。用HE染色观察脾脏的病理学改变。结果:TFA不仅能明显延长辐射损伤小鼠的平均存活天数,提高小鼠30d存活率(P<0.05);而且能显著降低辐射损伤小鼠外周血白细胞的下降幅度、缩短其恢复所需时间(P<0.05);同时,TFA还能促进小鼠脾重指数的恢复,减轻辐射对小鼠脾脏的损伤程度,促进造血灶增生,加快造血功能恢复。结论:TFA具有较强的抗辐射作用,能显著提高受致死剂量60Coγ射线照射小鼠的存活率,降低辐射对小鼠外周血WBC和PLT及脾脏的损伤作用,其具体作用机制有待进一步深入研究。

土壤理化性质与乌头植物有效成分的相关性研究

目的：考察土壤各种因子与川乌头中有效成分含量之间的关系.方法：采用一元回归及二元回归等方法对土壤生态因子与乌头植物有效成分的相关性进行分析.结果：乌头植物有效成分含量与土壤pH值均呈负相关;土壤有机质含量在5.59%-6.20%之间,有效氮、磷、钾含量分别在300-340 mg/kg,35-59.5 mg/kg,151-285 mg/kg之间时,有利于乌头植物有效成分含量的积累.

黄芪总黄酮的改良提取方法

目的:研究黄芪总黄酮(Total Flavonoids of Astragalus,TFA)的分离纯化方法。方法:以分析纯芦丁为标准,在260nm波长处检测黄芪粗提物、乙酸乙酯改良萃取法提取物和聚酰胺静态吸附法提取物的TFA含量。结果与结论:乙酸乙酯改良萃取法提取物中TFA含量高达71.7%,而聚酰胺静态吸附法提取物中TFA含量为28.3%。

21.5kD MBP RNAi有效靶点的筛选及验证

目的:构建21.5 kD MBP基因干扰序列21.5 kD MBP-shRNA(21.5 kD MBP short hairpin RNA interference),筛选最佳沉默效果的21.5 kD MBP-shRNA真核表达载体,为21.5 kD MBP基因功能研究提供实验材料。方法:将21.5 kD MBP-shRNA阳性真核表达载体和阴性真核表达载体经脂质体介导分别转入人神经胶质瘤细胞株U251中,观察转染24 h后的转染效率;提取各组细胞总RNA,用实时荧光定量PCR技术检测各组21.5 kD MBP基因在mRNA水平的表达差异性。结果:21.5kD MBP-shRNA真核表达重组载体被成功转染入U251细胞,与阴性对照质粒(pGenesil-1-MBP-neg)转染组相比,沉默质粒转染组(pGenesil-1-MBP-1、pGenesil-1-MBP-2、pGenesil-1-MBP-3质粒分别转染)细胞中21.5 kD MBP mRNA表过水平均显著下降(P<0.05),其中pGenesil-1-MBP-3转染组细胞中21.5 kD MBP mRNA表达水平最低。结论:成功筛选出最佳沉默效果的21.5 kD MBP-shRNA真核表达载体,为21.5 kD MBP基因功能研究及基因治疗研究奠定了实验基础。

黄芪总黄酮对辐射肝癌细胞的促凋亡作用

目的从细胞和蛋白水平研究黄芪总黄酮(total flavonoids of astragalus,TFA)对辐射肝癌细胞的促凋亡作用。方法以对数生长期的HepG-2肝癌细胞为实验对象,克隆形成实验检测细胞的辐射敏感性;流式细胞技术分析细胞凋亡率;Western blot技术分析凋亡相关蛋白Fas、Bcl-2、Bax的表达。结果细胞克隆形成实验结果显示,TFA给药照射组能够明显抑制HepG-2细胞增殖,作用强于单纯TFA给药组和单纯照射组。流式分析结果也提示,经6Gyγ射线一次性照射6、24h和48h后,TFA预处理组肝癌细胞HepG-2的细胞凋亡率分别为(11.6±2.2)%、(17.3±1.5)%和(20.1±2.8)%,单纯照射组HepG-2的细胞凋亡率分别为(6.9±2.3)%、(9.3±3.5)%和(15.8±2.1)%。Westernblot分析结果提示,在肝癌细胞HepG-2中,TFA预处理照射组促凋亡蛋白Fas和Bax的表达量显著高于单纯照射组和对照组;凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达量正好与此相反,TFA预处理照射组Bcl-2的表达量明显低于单纯照射组和对照组。结论 TFA对肝癌细胞不仅没有辐射保护作用,而且能够增强辐射对肝癌细胞的毒性作用。

南充道地药材半夏的遗传多样性分析

目的:对南充道地药材半夏的遗传多样性进行研究,为半夏的保护利用提供参考.方法:采用随机扩增多态DNA(RAPD)方法对60份半夏基因组进行扩增,所获数据通过NTSYS-pc v2.1、POPGENE v1.31及Arlequin3.0进行分析.结果:从43条引物中筛选出22条条带清晰且重复性好的引物用于实验和统计分析,共扩增出88个位点,多态性位点占79.5%,表现出较高的遗传多样性.分子方差分析表明各来源地内材料间差异构成了遗传变异的主要来源.聚类分析显示,所有供试半夏可明显聚为三类,其中栽培种分布较集中.组间遗传差异分析表明大部分来源地间差异不显著,组间基因流动较频繁.结论:南充地区的半夏资源具有较高的遗传多样性;材料间遗传距离的远近与其地理来源有一定相关性,野生种的遗传背景较栽培种更为丰富,说明人为的引种、筛选、栽培已对半夏资源的多样性造成了影响.因此,应尽快建立半夏种质资源库,通过形态学、细胞学及分子生物学技术进行系统分类,为保护利用半夏资源提供理论依据和物质基础.

MBP不同cDNA序列真核表达载体的构建及鉴定

目的以pEGFP-N1质粒载体为介导,构建针对髓鞘碱性蛋白(MBP)不同isoform cDNA的表达载体。方法将三段不同MBPcDNA序列克隆入pEGFP-N1质粒,转化DH5α感受态细胞,酶切鉴定及测序。结果测序结果显示插入的三段目的片段的序列与理论序列一致。结论笔者成功构建了pEGFP-N1-MBP21.5,pEGFP-N1-MBP18.5和pEGFP-N1-MBP17.3三个重组真核表达载体,为进一步研究不同MBP cDNA在真核细胞中的表达情况和功能差异奠定基础。

黄芪总黄酮对人正常骨髓间充质细胞的抗辐射损伤作用

目的:探讨黄芪总黄酮(total flavonoids of Astragalus;TFA)对60Coγ射线照射后人正常骨髓间充质干细胞(human mes-enchymal stem cells hMSCs)的辐射防护作用。方法:用MTT法检测直接接受照射的hMSCs及照射前经不同浓度TFA预处理的hM-SCs细胞存活率。利用琼脂糖电泳半定量分析直接照射后hMSCs和照射前TFA预处理的hMSCs的DNA凋亡梯带形成情况。分别于照射后不同时间收集细胞,流式细胞仪定量分析细胞凋亡率。结果:TFA的剂量在0.05～0.20mg/ml范围内与hMSCs的存活率呈良好的剂量-效应关系;照射后62、4、48h,各TFA照射组hMSCs较单纯照射组hMSCs凋亡率均低;琼脂糖电泳结果与流式分析结果相吻合。结论:TFA对人正常骨髓间充质细胞60Coγ射线照射后具有防护作用,其作用在一定范围内与TFA浓度成正比。