体外共培养诱导脂肪干细胞向软骨表型细胞分化及鉴定的实验研究

目的:探讨脂肪干细胞经共培养诱导为软骨表型细胞的可行性,为软骨组织工程种子来源提供的新途径。方法:分离培养日本大耳白兔的脂肪干细胞及肋软骨细胞,将脂肪干细胞与软骨细胞分层共培养及脂肪干细胞单独培养于6孔板中2周。通过safranin-O染色、甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫化学染色对诱导后细胞表型进行鉴定,RT-PCR检测诱导后Ⅱ型胶原基因表达情况。结果:共培养诱导2周后的脂肪干细safranin-O染色和甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫化学染色呈阳性,Ⅱ型胶原基因表达接近于正常软骨细胞。结论:脂肪干细胞经与软骨细胞共培养后,可以诱导为软骨表型细胞。

Ⅱ型胶原-透明质酸构建组织工程软骨复合三维纳米支架的体外实验研究

目的探讨Ⅱ型胶原-透明质酸（hyaluronic acid，HA）构建软骨组织工程复合三维纳米支架的可行性。 方法将Ⅱ型胶原和HA以8∶1（W∶W）比例溶于三氟乙醇和水按1∶1（V∶V）比例混合的溶剂中制成溶液，通过静电纺丝技术制备三维多孔纳米支架材料，通过光镜和扫描电镜观察其表面形貌，测定其孔隙率、吸水率、表面接触角和降解率。取1周龄日本大耳兔肋软骨，采用酶消化法制备软骨细胞。取第2代软骨细胞种植于支架上，用细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8）评价其细胞黏附性及增殖情况；细胞-支架复合物体外连续培养2周后，行组织学和免疫组织化学染色观察其生物学形态及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）分泌情况。 结果以最佳电纺液浓度为10%、接收距离为10 cm、纺丝注射速度为5 mL/h电纺获得的支架材料，光镜及扫描电镜观察示其孔隙均匀，纳米纤维直径均匀（300～600 nm），孔隙率为89.5% ± 25.0%，表面接触角为（35.6 ± 3.4）°，24 h内支架吸水率可达1 120% ± 34%，48 d内支架降解率可达42.24% ± 1.51%。CCK-8检测结果显示，培养12 h细胞在支架上黏附率可达169.14% ± 11.26%，培养7 d时细胞存活率可达126.03% ± 4.54%。组织学和免疫组织化学染色示，细胞在支架上黏附增殖情况良好，可分泌ECM；细胞在支架上培养2周后，有类似于软骨陷窝的结构形成。 结论以Ⅱ型胶原-HA制备的复合三维纳米支架材料具有良好的物理性能、生物学性能和促进细胞黏附及增殖的能力，是一种良好的组织工程软骨支架材 料。

钛表面微纳结构制备及原位沉积磷酸钙

目的钛表面结构及成分会影响钛和骨组织的界面键合,为增强钛表面的生物活性,促进材料与骨组织的键合,本文旨在钛表面构建微纳结构并原位沉积磷酸钙。方法首先,通过碱热处理,在钛表面构建微纳结构。将处理后的钛置于添加环己烷六羧酸(H_6L)的钙磷溶液中,进行水热处理。采用SEM,EDX,XRD及FTIR等分析手段对材料进行表征。此外,考察了钛碱热处理与原位沉积磷酸钙钛表面成骨细胞生长情况。结果 240℃碱热处理下,钛表面生成平均长度在8μm左右的钛酸钠纳米线。经过二次水热后,磷酸钙颗粒在纳米线上发生原位沉积,而未加入H_6L的钙磷溶液中,纳米线上没有发生磷酸钙沉积。这说明,H_6L的加入有利于磷酸钙在纳米线上沉积。细胞结果表明,原位沉积磷酸钙的钛表面更有利于细胞增殖。结论本文通过二次水热的方法,成功在钛表面制备出含磷酸钙/纳米线的多级微纳结构,有望应用于骨植入材料表面改性。

Slit2／Robo4信号通路对小鼠心肌微血管内皮细胞增殖和迁移的影响

目的检测分泌型细胞外基质糖蛋白Slit2及其受体Rob04蛋白在小鼠心室肌的血管组织中的表达情况，探讨Slit2／Rob04信号通路对小鼠心肌微血管内皮细胞增殖及迁移的影响。方法免疫组织化学法检测小鼠心室肌的血管组织中Slit2、Rob04蛋白的表达情况。从小鼠心室肌分离出微血管内皮细胞，通过免疫荧光和酶联免疫法分别检测小鼠心肌微血管内皮细胞中Rob04和Slit2蛋白的表达情况。利用CCK-8试剂盒，观察不同浓度外源性的Slit2对小鼠心肌微血管内皮细胞增殖的影响。利用transwell小室，设计对照组、VEGF组、Slit2组（100rig／mlSlit2），Slit2＋VEGF组（100ng／ml Slit2＋10ng／mlVEGF），观察外源性Slit2对小鼠心肌微血管内皮细胞迁移的影响。结果免疫组织化学结果显示小鼠心室肌的血管组织中Slit2、Rob04蛋白均有表达。RT—PCR及免疫荧光检测结果显示小鼠心肌微血管内皮细胞中有Robo4 mRNA及其蛋白的表达。酶联免疫法检测结果显示小鼠心肌微血管内皮细胞中有Slit2蛋白的表达。在细胞增殖实验中，不同浓度的Slit2组450nm处的吸光度值与阴性对照组比较差异均无统计学意义（P均〉0．05）。在细胞迁移实验中，Slit2组小鼠心肌微血管内皮细胞迁移数为（22．1±2．8）与对照组的（23．2±3．8）比较差异无统计学意义（P〉0．05），Slit2组小鼠心肌微血管内皮细胞迁移数为（22．1±2．8），Slit2组小鼠心肌微血管内皮细胞迁移数为（22．1±2．8）与VEGF组的（65．3±3．8），Slit2＋VEGF组的（29．2±3．4）之间比较差异均有统计学意义（P均〈0．05）。结论Slit2、Robo4蛋白均表达于小鼠心室肌组织，Rob04蛋白表达于小鼠心肌微血管内皮细胞，不同浓度的外源性Slit2对小鼠心肌微血管内皮细胞的增殖没有影响。100ng／ml外源性Slit2可抑制VEGF诱导的小鼠心肌微血管内皮细胞迁移。