2006年细菌对抗菌药物耐药机制研究进展回顾

细菌对抗菌药物的耐药性机制是生物医药研究的重要领域。2006年抗菌药物耐药机制研究在多方面有重要的发现,如对细菌药物主动外排泵的药物转运结构机制的深入了解及发现新的药物泵或新的泵调控表达机制,发现了喹诺酮类药物修饰酶、质粒介导的喹诺酮耐药性在世界范围内的出现,对金葡菌耐药机制的进一步认识与发现新型抗多重耐药革兰阳性球菌的platen-simycin,鲍曼不动杆菌基因多重耐药岛的发现,新型β-内酰胺酶的继续出现以及超广谱β-内酰胺酶开始从食用动物或宠物分离的细菌中证实。本文还讨论了2006年中国细菌耐药机制研究的一些重要结果。这些研究成果继续提示细菌对不同抗菌药物的多种耐药保护机制及细菌本身基因结构的多样性与可移动性使其能进化产生新的耐药机制以适应抗菌药物的作用。严谨合理地应用抗菌药物以最大限度地减少细菌耐药性发生及传播和延长抗菌药物的疗效周期是人类所面临的长期挑战。

铜绿假单胞菌临床分离株gyrA基因突变与喹诺酮类药物耐药关系研究

目的:研究铜绿假单胞菌临床分离株gyrA基因突变与喹诺酮类药物耐药关系,并对聚合酶联反应(PCR)-限制性片段长度多态性(RFLP)-DNA单链构象多态性(SSCP)分析铜绿假单胞菌临床分离株gyrA基因突变的可行性进行评估。方法:以铜绿假单胞菌临床分离株gyrA基因序列为靶序列,用PCR、PCR-RFLP、PCR-SSCP、DNA测序等方法对铜绿假单胞菌ATCC27853及16株临床分离株gyrA基因突变进行对比研究。结果:在8株耐环丙沙星铜绿假单胞菌中,有6株gyrA基因的83位表现出单点突变,其突变方式全为ACC→ATC,导致氨基酸苏氨酸→异亮氨酸的改变;gyrA基因的PCR扩增产物SacⅡ酶切片段与测序结果一致;SSCP分析结果显示,16株细菌中仅2株gyrA带型与ATCC27853相同,其它菌株gyrA带型与ATCC27853均不同。结论:临床分离的铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物耐药的分子机制主要表现为gyrA基因83位氨基酸密码子突变,应用PCR-RFLP-SSCP系统可快速、准确地检测耐喹诺酮类药物的铜绿假单胞菌gyrA中碱基的变异。

革兰阴性杆菌临床分离株对β-内酰胺类抗菌药物的耐药性研究

目的研究医院感染革兰阴性(G-)杆菌对β-内酰胺类抗菌药物的耐药性特征及耐药机制。方法测定泵抑制剂对MIC的影响,β-内酰胺酶(Bla)的表型鉴定及等电点测定,PCR扩增检测Bla基因及DNA序列测定。结果所试菌对大多数药物的耐药率高,均产Bla,其中42.1%产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)、17.5%产头孢菌素酶(AmpC酶)、7.0%产金属β-内酰胺酶,10.5%同时为外排泵阳性菌;8株阴沟肠杆菌的ampC基因与阴沟肠杆菌ECLC074的ampC基因高度同源。结论产Bla是G-杆菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要机制,ESBLs检出率最高;产AmpC酶阴沟肠杆菌的ampC基因均起源于ECLC074的ampC基因;亚胺培南是治疗耐药G-杆菌所致感染最有效的药物,β-内酰胺酶抑制剂复合物和阿米卡星可分别用于治疗耐药非发酵杆菌和持续高产AmpC酶阴沟肠杆菌所致感染。

课外学习任务法在天然药物化学课程教学中的应用

目的探讨课外学习任务法在《天然药物化学》理论课教学中的应用效果。方法以川北医学院药学专业2019级和2020级学生为教学对象,分别采用无和有课外学习任务法进行《天然药物化学》理论课教学,以期末测试成绩对该法在《天然药物化学》理论课教学效果进行评价,并通过调查问卷了解学生的意见。结果期末测试成绩表明,引入课外学习任务法的教学模式优于未引入的教学模式(P=0.0381),且及格率提高了22.5%。同时超过95%的参与问卷调查的学生认为课外学习任务法可提升成绩与专业能力。结论课外学习任务法能提高《天然药物化学》课程教学效果与质量,能与混合式教学、个性化教育改革相融合,值得提倡和推广。

鹅不食草水煎剂对绿脓杆菌R质粒体外消除作用的实验研究

目的 探讨中药鹅不食草水煎剂对绿脓杆菌R质粒的消除作用。方法 对临床分离的绿脓杆菌R质粒进行了检测,并选用中药鹅不食草水煎剂对该质粒进行了体外消除试验。结果 体外药物作用24h、48h、72h,R质粒消除率分别为0.7％、4.7％、46.3％,SDS对照组分别为0.3％、0.7％、1.7％。结论 鹅不食草对耐药质粒有较强的消除作用。

鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合子与多重耐药相关性研究

目的了解临床分离鲍曼不动杆菌的耐药状况、Ⅰ类整合子的分布情况,探讨Ⅰ类整合子与多重耐药的关系。方法检测20种临床常用抗菌药物对鲍曼不动杆菌临床分离株的最低抑菌浓度(MIC)。PCR扩增Ⅰ类整合酶基因。对部分Ⅰ类整合酶阳性菌株进行耐药基因盒序列分析。结果鲍曼不动杆菌呈现多重耐药,鲍曼不动杆菌对IMP和MRP耐药率分别为0.9%和1.8%,对CPZ/SB的耐药率为35.7%,对其它抗菌药物的耐药率均大于60%,多重耐药率为76.8%(86/112),但对COL和MIN均敏感。80.4%(90/112)的菌株检测出Ⅰ类整合子。Ⅰ类整合子阳性株对多种药物的耐药率均高于阴性株,且Ⅰ类整合子阳性株多重耐药率(90%)明显高于阴性株(22.7%)(P<0.01)。Ⅰ类整合子基因盒序列分析显示,Ⅰ类整合子携带aacA4,catB8和aadA13种耐药基因。结论Ⅰ类整合子在鲍曼不动杆菌中检出率很高并与其多重耐药性关系密切。

73株耐阿莫西林临床分离革兰阴性菌的β-内酰胺酶活性研究

目的了解革兰阴性杆菌对阿莫西林的耐药机制,探讨MIC与β-内酰胺酶活性之间的相关性.方法收集2003年2月至2004年1月全院分离出的耐阿莫西林革兰阴性杆菌73株,琼脂二倍稀释法测定阿莫西林MIC;超声破碎法提取β-内酰胺酶;对β-内酰胺酶进行定性检测和活性测定.结果13.7%的革兰阴性杆菌MIC≤1024μg/mi,86.3%的革兰阴性杆菌MIC＞1024μg/ml;酶活性＜1000U、1000～10000U、＞10000U的细菌分别为53.42%,41.10%和5.48%;大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌及其它革兰阴性杆菌的酶活性中位数分别为1343.32、1584.71、301.675、256.41和984.33U(Kruskal-Wallis H检验,P＜0.05).结论革兰阴性杆菌对阿莫西林多呈高度耐药,且主要为大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌;耐药阴沟肠杆菌和大肠埃希菌的酶活性明显高于铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌;酶活性和MIC之间没有必然的正相关关系,提示革兰阴性杆菌对阿莫西林耐药系多种机制共同参与的结果.

大肠埃希菌临床分离株I类整合子分布与耐药相关性研究

目的川北地区大肠埃希菌的整合子携带情况及其与耐药性之间的关系。方法采用琼脂稀释法测定临床分离的180株大肠埃希菌对15种抗菌药物的敏感性，敏感、中介、耐药采用美国临床实验室标准化协会（CSLI）2006年公布的标准判定。PCR方法检测临床大肠埃希菌中的第一类整合酶基因（伽们，应用统计学方法比较第一类整合酶基因（加们阳性与阴性菌株的耐药性差异，分析I类整合子与耐药性形成的的相关性。结果180株大肠埃希菌对氨苄西林、环丙沙星、左旋氧氟沙星、庆大霉素、复方磺胺甲嗯唑、头孢唑啉、妥布霉素、氨苄西林／舒巴坦、头孢曲松的耐药率高，达32．9％～92.3％。临床分离180株大肠埃希菌中intI携带率为64．4％，intI阳性菌株对β-内酰胺类、喹诺酮类和氨基糖苷类等抗菌药物呈现多重耐药性。结论川北地区大肠埃希菌对临床常用抗菌药物耐药突出。intI携带率高，并且与耐药性的形成关系密切。

细菌β-内酰胺酶对4种头孢菌素的水解作用及三唑巴坦的抑酶效应研究

目的比较头孢噻肟(CTX)与头孢噻吩(CET)、头孢哌酮(CPZ)和头孢唑林(CEZ)对细菌β-内酰胺酶的稳定性及不同浓度的三唑巴坦(TB)之抑酶效应,为进一步研究开发头孢菌素/TB复方制剂提供依据。方法用超声破碎法提取11株临床分离菌和4株标准产酶菌的β-内酰胺酶,用紫外分光光度计测定酶对抗生素的水解率,并计算4种配伍比例的三唑巴坦(头孢菌素/TB分别为4∶1、3∶1、2∶1和1∶1)的抑酶率。结果CTX对酶的稳定性最高,其水解率(15.95±17.40)%明显低于其余三种药物(P<0.05);CPZ和CEZ的稳定性相当,其水解率分别为(45.10±12.68)%和(39.55±19.66)%(两者比较,P>0.05);CET的稳定性明显低于其它三种药物(P<0.05)。加用TB后,酶对4种抗生素的水解率明显降低。其中TB对CPZ和CEZ的抑酶保护作用相当(其平均抑酶率多大于70%,且2/3的细菌酶的抑制率在50%以上),对CTX保护作用也较强(平均抑酶率在50%以上)。但同一药物的4种配伍制剂中头孢菌素的水解率无显著性差异(P>0.05)。结论TB能有效抑制酶对所试4种头孢菌素的水解,4种配伍比例的TB对酶的抑制作用无显著差异。

鲍曼不动杆菌耐药表型与外排泵基因表达水平的研究

目的探讨鲍曼不动杆菌临床分离株对常用抗菌药物的耐药性及与外排泵adeA基因表达水平之间的关系。方法琼脂二倍稀释法检测鲍曼不动杆菌临床分离株对17种常用抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC);PCR法扩增外排泵编码基因adeA;实时荧光定量RT-PCR(Real Time Fluorescent Quantitative RT-PCR)法检测adeA基因的mRNA表达水平。结果药敏结果显示86株鲍曼不动杆菌对多粘菌素B全部敏感(100%),其次是美罗培南(73.2%)、亚胺培南(70.9%)。耐药率最高的是庆大霉素(84.9%),其次为美罗西林(83.7%)和环丙沙星(79.1%)。55株菌为多重耐药株(64%),其中5株(5/86)对多粘菌素B外的所有抗菌药物耐药(5.8%)。adeA的检出阳性率为84.9%(73/86),Real Time RT-PCR结果显示多重耐药菌株adeA基因的mRNA相对表达量均高于敏感菌株,其中3株相对表达量为敏感菌株平均表达水平的30倍以上。结论鲍曼不动杆菌临床分离株耐药情况严重,其主动外排系统adeA基因表达增强在多重耐药性形成中起重要作用。

鲍曼不动杆菌耐药性及β-内酰胺酶基因型研究

目的调查川北地区鲍曼不动杆菌耐药性及β-内酰胺酶基因型。方法用Vitek 32细菌鉴定系统对细菌进行鉴定。用琼脂稀释法测定鲍曼不动杆菌对16种抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)。用聚合酶链反应(PCR)法检测β-内酰胺酶耐药基因,并对耐药基因测序分析。结果78株鲍曼不动杆菌对亚胺培南全部敏感,对美罗培南的耐药率为1.3%,对头孢哌酮/舒巴坦的耐药率为37.2%,对其它13种抗菌药的耐药率均在60%以上。21株多重耐药鲍曼不动杆菌均携带TEM型基因,其中,同时还携带SHV和CTX-M型基因的分别有14株和7株,经DNA测序,TEM基因均为TEM-128,CTX-M基因为CTX-M-2,SHV基因可能为SHV-5、SHV-1b、SHV-56、SHV-71或SHV-96。结论川北地区鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药存在严重耐药现象,β-内酰胺酶耐药基因型以TEM-128为主,同时也有SHV和CTX-M,部分菌株携带两种以上β-内酰胺酶耐药基因参与细菌耐药性的形成。

耐头孢他啶阴沟肠杆菌TEM-28V β-内酰胺酶的特性研究

目的研究耐头孢他啶阴沟肠杆菌TEM-28Vβ-内酰胺酶的特性。方法用KB纸片扩散法和等电聚焦(IEF)对细菌β-内酰胺酶类型进行初步判断;碱裂解法提取质粒并进行PCR扩增测序;饱和硫酸铵反抽提,并经SephadexG-75凝胶过滤和DE-52阴离子交换层析法纯化β-内酰胺酶;SDS-PAGE法测定分子量和紫外分光光度法测定酶动力学参数。结果6株临床分离菌均对头孢他啶耐药。IEF显示,每株菌产生一种或两种β-内酰胺酶,等电点(pI)分别为5.5、5.6和8.7。根据基因分析推测,pI为5.6的酶的氨基酸序列与TEM-2同源性为100%。pI为5.5的酶与TEM-28比较存在4个氨基酸突变,其分子量为28.77ku;酶动力学分析证实,TEM-28V能水解头孢他啶、头孢噻肟和氨曲南,不能水解亚胺培南,对舒巴坦和三唑巴坦的IC50分别为107和220nmol/L。结论TEM-28V可能为TEM-28变异型超广谱β-内酰胺酶。

细菌CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因定点突变对酶活性的影响研究

目的构建CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因突变体,比较突变前、后酶活性的变化,进一步阐明酶的分子结构特征和生化特性。方法利用重叠延伸PCR定点诱变技术将CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因Ser240(丝氨酸)AGC定点突变为Gly240(甘氨酸)GGC,分别构建CTX-M型酶的原核重组表达载体及其突变表达载体,重组载体经酶切鉴定和DNA测序鉴定后,转化大肠埃希菌JM109,比较突变前、后酶活性的改变。结果酶切鉴定和DNA测序鉴定表明CTX-M型酶的原核重组表达载体及其突变表达载体构建成功,转化大肠埃希菌JM109后,发现含野生型CTX-M基因的重组菌其酶活性与来源菌株相近,而含突变型CTX-M基因的重组菌未检测到酶活性。结论Ser240对于维持CTX-M型超广谱β-内酰胺酶活性具有重要作用。

碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌adeB外排泵基因表达与多重耐药相关的研究

目的了解临床分离碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌对常用抗菌药物的耐药情况,并探讨对碳青霉烯类药物耐药与AdeABC主动外排泵表达及碳青霉烯酶OXA-23存在的关系。方法采用琼脂二倍稀释法测110株临床分离菌对常用20种抗菌药物的MICs;用泵抑制剂氰氯苯腙(CCCP)检测分离菌的外排表型;用PCR技术扩增外排泵结构基因adeB、adeJ、abeM及碳青霉烯酶基因bla OXA-23;RT-PCR方法检测adeB的mRNA相对表达量。结果 32株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌除对多黏菌素B全部敏感外,对其他抗菌药物的耐药率均大于90%;96.9%(31/32)的耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌含adeB、adeJ和bla OXA-23基因,93.8%(30/32)的含abeM基因。另78株敏感菌中,adeB、adeJ、abeM基因的检出率分别为78.2%、79.5%和80.8%;与耐药菌相比,敏感菌的adeB基因mRNA相对表达量显著较低。110株临床分离菌中,美罗培南加CCCP共筛出15株泵阳性菌。结论耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌对临床常用的多种抗菌药物耐药;外排泵机制和碳青霉烯酶OXA-23在介导鲍曼不动杆菌多重耐药中具有重要作用。

耐头孢他啶大肠埃希氏菌产β-内酰胺酶的特性研究

目的:研究耐头孢他啶大肠埃希氏菌产β-内酰胺酶的特性。方法:采用K-B纸片扩散法和等电聚焦对2株耐药大肠埃希氏菌产β-内酰胺酶类型进行初步判断;采用碱裂解法提取质粒并进行PCR扩增测序;β-内酰胺酶经饱和硫酸铵反抽提及SephadexG-75凝胶过滤和DE-52阴离子交换层析法纯化;以SDS-PAGE法测定其分子量及紫外分光光度法测定其酶动力学参数。结果:2株菌产生一种等电点为8.7的超广谱β-内酰胺酶(CTX-M-1V),分子量为29kDa,能水解头孢噻肟和氨曲南,不能水解亚胺培南,对舒巴坦(IC50=94nmol/L)和他唑巴坦(IC50=5nmol/L)敏感。结论:CTX-M-1V为对抑制剂敏感的CTX-M型超广谱-内酰胺酶。

脱氧核酶抑制细菌TEM-1 β-内酰胺酶基因表达的实验研究

目的观察10-23脱氧核酶对细菌TEM-1酶基因表达的抑制作用。方法PCR扩增TEM-1酶全编码基因,将其连接入pBK-CMV载体中,并在大肠埃希菌JM109中表达。设计并合成针对blaTEM-1的10-23脱氧核酶、反义寡核苷酸,采用氯化钙法将其分别导入表达blaTEM-1的大肠埃希菌中,观察细菌导入脱氧核酶后,在含氨苄西林(100μg/ml)培养基中的生长活力及β-内酰胺酶活性的变化。结果10-23脱氧核酶导入表达blaTEM-1的大肠埃希菌后,在含氨苄西林(100μg/ml)的培养基中大肠埃希菌的生长活力明显低于反义寡核苷酸和空白对照组,导入脱氧核酶的大肠埃希菌β-内酰胺酶活性也明显低于反义寡核苷酸和空白对照组。结论10-23脱氧核酶能特异性地抑制细菌blaTEM-1酶基因表达。

10-23脱氧核酶抑制细菌β-内酰胺酶基因表达的实验研究

目的:观察10-23脱氧核酶对细菌β-内酰胺酶基因表达的抑制作用。方法:设计并合成针对细菌β-内酰胺酶SHV-5基因的10-23脱氧核酶、反义寡核苷酸和无关对照寡核苷酸,采用电穿孔法将其分别导入表达β-内酰胺酶SHV-5的大肠杆菌中,观察耐药菌在导入脱氧核酶后,在含β-内酰胺类抗菌素培养基中的生长活力及β-内酰胺酶表达量的变化。结果:10-23脱氧核酶导入表达blaSHV-5的大肠杆菌后,在含头孢他啶的培养基中大肠杆菌的生长活力明显低于反义寡核苷酸和无关对照DNA转化的大肠杆菌,导入脱氧核酶的大肠杆菌其β-内酰胺酶表达量也明显低于反义寡核苷酸和无关对照DNA转化的大肠杆菌。结论:10-23脱氧核酶能特异性地抑制细菌β-内酰胺酶基因表达。

棓丙酯与抗生素联合抗多重耐药鲍曼不动杆菌作用研究

目的探讨棓丙酯与临床上常用抗生素(头孢他啶、环丙沙星和阿米卡星)对多重耐药鲍曼不动杆菌的联合抑菌作用。方法根据临床药敏结果选取9株鲍曼不动杆菌多重耐药菌株和鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC19606作为实验对象,用棋盘滴定法测定棓丙酯分别与头孢他啶、环丙沙星和阿米卡星的联合抑菌效应。结果除鲍曼不动杆菌标准菌株外,9株鲍曼不动杆菌多重耐药菌株对三种抗生素皆耐药,棓丙酯对各株细菌均有一定的抑制作用,且对耐药株和标准菌株的最低抑菌浓度(MIC)基本相同;棓丙酯分别与头孢他啶、环丙沙星、阿米卡星联用后抑菌作用表现为相加。结论棓丙酯对鲍曼不动杆菌生长具有抑制作用,与抗生素联用后抗菌活性增加。

多重耐药鲍曼不动杆菌16S rRNA甲基化酶研究进展

氨基糖苷类抗生素在治疗鲍曼不动杆菌引起的感染中起着重要的作用。而鲍曼不动杆菌对该类抗生素的耐药机制主要包括产氨基糖苷修饰酶,外膜孔蛋白表达缺失,药物外排泵的表达和核糖体结合位点的改变等。质粒介导的16S rRNA甲基化酶是近年在多重耐药鲍曼不动杆菌中发现的一种新的耐药机制,可导致对氨基糖苷类抗生素的高水平耐药。本文就细菌rRNA的修饰作用、16S rRNA甲基化酶的发现、耐药与传播机制、耐药菌的流行、多重耐药鲍曼不动杆菌16S rRNA甲基化酶基因的研究进展等方面作一综述。