枯草芽孢杆菌工程菌株产普鲁兰酶发酵条件的优化

利用基因工程手段获得的产长野芽孢杆菌普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌株WB600/pWB-pulB,通过单因素筛选及正交试验进行发酵培养基优化,得到产酶最佳配方为玉米淀粉3.0%,酵母膏2.0%,CaCl20.03%,Na2HPO41.0%。同时对重组菌株摇瓶条件下液体发酵的主要影响因素初始pH、接种量、装液量、转速、温度等进行探讨,确定了产酶最佳培养条件为,以3%接种量接种于优化后培养基,初始pH7.0,装液量30 mL/250 mL,37℃,200 r/min摇床培养36 h。在此优化条件下,普鲁兰酶活力达到20.16 U/mL,是之前研究结果(10.94 U/mL)的1.84倍。

毕赤酵母表面展示磷脂酶D高密度发酵优化

利用基因工程手段构建获得的一株细胞表面展示表达磷脂酶D的毕赤酵母工程菌株GS115/pKFS-pld,通过摇瓶单因素筛选进行发酵条件优化,确定了最佳发酵条件为:诱导产酶阶段28℃,初始pH6.5,甲醇浓度1.5%,装液量为30 mL/250 mL,250 r/min摇床培养144 h。在此优化条件下菌体量为19.6 g/L,酶活达17.8×10-7kat/g,分别是是优化前的1.38及1.44倍。同时进行了5 L规模发酵罐分批补料培养,结果表明15 mL(/L.h)速率流加甘油补料培养基6 h后,采用溶氧恒定流加法流加甲醇,诱导132 h后,菌体量及PLD活力分别达到67.4 g/L及27.3×10-7kat/g,是摇瓶发酵水平的3.44倍及1.53倍。

两种α–葡萄糖苷酶的酶学性质及转苷作用

来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的不同α–葡萄糖苷酶,其对底物的水解和转苷活性均存在一定差异,影响了它们在实际生产中的应用.以甲醇毕赤酵母重组菌株分别表达的两种α–葡萄糖苷酶Glu-A和Glu-B为研究对象,分析了两种酶的酶学性质,结果表明Glu-A和Glu-B最适作用温度均为50,℃,最适p H分别为5和6.对底物麦芽糖的转苷作用研究表明,产物低聚异麦芽糖中各种糖的种类和比例差别较大,Glu-A作用麦芽糖后的总低聚糖、异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖的生成率分别为51.04%、15.79%、31.41%和4.18%,而Glu-B作用麦芽糖后的总低聚糖、异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖的生成率分别为35.85%、16.71%、4.15%与15.85%.

饲用耐酸抗蛋白酶β–甘露聚糖酶的筛选分离及酶学性质

β–甘露聚糖酶作为饲料添加剂,不仅可以有效降解并消除饲料中的抗营养因子,还可以进一步增强动物的免疫反应并调控动物胃肠道中的微生态平衡.然而目前已发现的大部分β–甘露聚糖酶的酸稳定性差,并且容易被动物肠道中的蛋白酶所降解,因此很难在实际应用中发挥理想的效果.本研究从一株高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus sublitis)中分离纯化到一种新型β–甘露聚糖酶,并对其酶学性质进行了研究;结果显示:该酶的最适作用温度为50,℃,最适催化pH为5.5,Zn^(2+)、Co^(2+)、Cu^(2+)、Fe^(3+)对该酶有明显的激活作用.稳定性研究表明:采用pH 2.0的酸性缓冲液处理1,h后,残余酶活仍能保持70%,以上;进一步采用20,U/m L的猪胰蛋白酶处理2,h,残余酶活仍在60%,以上,表明该酶不仅具有较好的酸稳定性,还对来源于猪胰腺的蛋白酶具有一定的抗性.这些研究结果显示:该酶作为一种新发现的β–甘露聚糖酶,在饲料行业中具有较好的研究前景和应用价值.

黑曲霉胞外β-葡萄糖苷酶的纯化及酶学性质的研究

利用硫酸铵盐析、Superdex 200凝胶柱层析等步骤,从黑曲霉发酵液中纯化得到两种β–葡萄糖苷酶蛋白,其相对分子质量分别为1.15×105和7.0×104左右,比活力分别为62.1,U/mg（相对分子质量约为1.15×10^5）和53.0,U/mg（相对分子质量约为7.0×10^4）,纯化倍数分别为1.54和1.31,回收率分别为19.6%,和19.1%,β–葡萄糖苷酶最适水解p H为4.6,最适反应温度为50~55,℃.在p H 4.2~4.8、温度40~60,℃下均能保持稳定.Mn2＋、Mg2＋和K＋对β–葡萄糖苷酶有不同程度的激活作用,而Ca^2＋、Fe^3＋、Zn^2＋、Cu^2＋和Fe^2＋会抑制β–葡萄糖苷酶的酶活,Na＋和Ba2＋对β–葡萄糖苷酶活力影响不明显.以p NPG为底物时,该酶的Km和vmax分别为2.33,mmol/L与3.14,mmol/（L·min）.

产青霉素酶枯草芽孢杆菌发酵条件的优化

目的:对一株产青霉素酶的重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis DB104/pWB-pemp)的摇瓶发酵条件进行优化。方法:利用单因素实验及正交实验等方法考查重组菌摇瓶发酵条件,研究不同浓度的碳源、氮源、金属离子、磷酸盐及不同pH、接种量、装液量和温度等条件对产青霉素酶的影响。结果:重组菌株摇瓶最适发酵条件为pH 7.0、接种量3%、装液量14%、发酵温度37℃,培养基成分为2%蔗糖、3.5%酵母膏、0.1mmol/L镁离子、0.4%磷酸盐。结论:最优条件下,发酵36h,产酶活力达到2227.8U/mL,为先前研究结果(1 580 U/mL)的1.41倍,为重组菌的大规模发酵生产奠定了基础。

培养条件对赭曲霉菌球形成和坎利酮11α羟基化的影响

菌丝粗壮、分布均匀的菌球可提高赭曲霉11α羟基化的效率。控制赭曲霉菌球直径的平均大小可以通过选择不同的培养温度、装液量、以及转速等因素而达到。通过正交分析，确定培养温度为30℃，按孢子悬液浓度为10。个／mL接种，装液量为50mL／250mL三角瓶，摇床转速为200r／min时，菌球达到最佳直径2～3rnrn之间的百分比最大。在此条件下，以10g/L的坎利酮投料，最终转化率高达91．26％。

隐球酵母vps41Δ菌株转化条件优化及突变体库构建

新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)是一种重要的条件致病性真菌。前期试验证实VPS41基因参与隐球酵母的氮源饥饿应答反应并影响其致病性。系统研究了影响农杆菌介导的vps41Δ饥饿应答缺陷型菌株关键因素,并利用优化的农杆菌转化体系构建了包含5 000多个转化子的vps41Δ菌株的T-DNA插入突变体库,为下一步筛选鉴定隐球酵母VPS41饥饿应答信号通路中的其他相关基因提供了基础材料。

赭曲霉的高密度培养对坎利酮转化的影响

目的:研究赭曲霉高密度培养的发酵培养基及条件,实现坎利酮的高转化。方法:选取廉价易得的培养基成分并进行优化,同时对发酵条件进行优化,得到了最优发酵培养基配方及培养条件。结果:发酵培养基最优配方为:葡萄糖20g/L,玉米浆20g/L,酵母膏20g/L,K2HPO4 2.5g/L。种子液最佳培养时间为24 h,发酵培养基初始pH 5.8,接种量为8%,装液量200mL/1 000mL,摇床转速为180 r/min,28℃,底物投料时间24 h,发酵结束时间72 h。结论:将该工艺在7 L发酵罐中放大,菌体密度达到25.36g/L,11α羟基坎利酮的转化率为86.1%。