高活性脐带间充质干细胞干预老年树鼩衰老脾脏的作用与机制

背景:脾脏具有储血、造血和免疫功能,随着年龄增长,脾脏结构退变、功能衰退引起免疫系统功能受损,进而加速机体衰老进程,而高活性脐带间充质干细胞治疗树鼩脾脏衰老尚未见报道。目的:探讨高活性脐带间充质干细胞对树鼩脾脏衰老的干预作用及机制。方法:从剖腹产的新生树鼩脐带组织中分离、培养和获得高活性脐带间充质干细胞,三系分化试剂盒检测成脂、成骨、成软骨分化能力,流式细胞术检测细胞周期和表面标志物。以感染复数值分别为100,120,140,160,180,200的吉凯基因绿色荧光蛋白转染第2代高活性脐带间充质干细胞,筛选最佳转染条件;转染后的第4代高活性脐带间充质干细胞尾静脉输注给老年治疗组树鼩,青年对照组和老年模型组不予特殊处理,治疗4个月时取脾脏组织,苏木精-伊红染色观察脾脏组织结构;β-半乳糖苷酶染色检测衰老相关半乳糖苷酶活性;免疫组织化学染色检测p21和p53蛋白表达水平;Ki67和PCNA免疫荧光染色检测细胞增殖活性;免疫荧光染色检测脾脏自噬蛋白分子Beclin1和APG5L/ATG5表达水平;活性氧荧光染色检测脾脏组织的活性氧含量;CD3免疫荧光染色检测总T淋巴细胞比例变化;酶联免疫吸附实验检测脾脏组织白细胞介素1β和转化生长因子β1分泌水平;DAPI复染细胞核观察绿色荧光蛋白标记的高活性脐带间充质干细胞在脾脏组织的分布情况。结果与结论:①高活性脐带间充质干细胞呈核小短梭形、鱼群样生长,G_(0)/G_(1)期占比大,具有向成脂、成骨和成软骨分化潜能。②感染复数为140且转染72 h为吉凯基因绿色荧光蛋白标记树鼩高活性脐带间充质干细胞的最佳条件。③与老年模型组相比,老年治疗组树鼩脾脏组织细胞排列紧密,白髓面积增加(P<0.01),红白髓界线清晰,生发中心占比无显著差异(P>0.05),脾脏组织衰老相关半乳糖苷酶活性水平降低(P<0.001),衰老蛋白分子p21和p53表达下调(P<0.001),增殖相关分子Ki67和PCNA表达上调(P<0.001,P<0.05),自噬相关分子Beclin1和APG5L/ATG5表达上调(P<0.001),活性氧含量降低(P<0.001),CD3^(+)T细胞比例增加(P<0.05),衰老相关分泌表型中白细胞介素1β分泌水平降低(P<0.001),转化生长因子β1分泌水平无显著差异(P>0.05)。与青年对照组相比,以上检测指标在老年治疗组中均有显著差异(P<0.05)。④冰冻组织切片观察可见老年治疗组树鼩脾脏组织中有绿色荧光蛋白标记的绿色荧光细胞。结果表明:静脉输注高活性脐带间充质干细胞可迁移至脾脏组织,抑制活性氧产生,下调衰老相关蛋白分子表达,诱导细胞自噬,促进细胞增殖,降低慢性炎症,进而改善脾脏组织结构和功能。

骨髓间充质干细胞对衰老猕猴胸腺及脾脏结构和功能的影响

背景:随着年龄的增长,脾脏的结构和功能发生改变,胸腺在青春期之后逐渐萎缩退化,导致机体发生免疫功能障碍。目的:探讨骨髓间充质干细胞对衰老猕猴胸腺及脾脏结构和功能的作用。方法:筛选出平均年龄25岁老年猕猴6只,随机分为老年组和老年治疗组各3只;老年治疗组猕猴经股静脉输注超顺磁性铁纳米颗粒标记的第4代骨髓间充质干细胞(1×10^(7)个/kg),1次/d,连续输注3 d,老年组猕猴在同一时间输注等体积的生理盐水;猕猴最后一次输注骨髓间充质干细胞5个月后给予安乐死处理,取出胸腺以及脾脏组织;苏木精-伊红染色观察胸腺组织和脾脏组织的结构变化;免疫荧光染色分析胸腺组织中各种T细胞亚群以及衰老相关基因蛋白P21的表达量变化;免疫组织化学染色分析脾脏组织中各种T细胞亚群以及衰老相关基因蛋白P21的表达量变化;安乐死处理猕猴之前抽取各组猕猴股静脉血5 mL,运用酶联免疫分析外周血血清中衰老相关分泌表型肿瘤坏死因子α和白细胞介素1α的分泌水平。结果与结论:①超顺磁性铁纳米颗粒标记的骨髓间充质干细胞经过股静脉输注入猕猴体内能够成功定植在衰老胸腺和脾脏组织中发挥作用;②骨髓间充质干细胞移植治疗后,衰老猕猴中胸腺部分组织出现清晰的皮质与髓质交界,脂肪细胞减少,出现胸腺小体,向正常的胸腺组织结构转变;衰老猕猴中脾脏组织出现清晰的红髓与白髓分界,脾小体的边缘多完整,且巨噬细胞减少,向正常的脾脏组织结构转变;③与老年组相比,老年治疗组衰老胸腺和脾脏组织中CD3^(+)、CD4^(+)以及CD8^(+)T细胞的表达量呈现增高的趋势,老年治疗组衰老胸腺和脾脏组织中P21蛋白的表达量呈现显著下降趋势;④与老年组相比,老年治疗组外周血中衰老相关分泌表型肿瘤坏死因子α以及白细胞介素1α的分泌水平呈现显著下降趋势;⑤上述结果表明,通过骨髓间充质干细胞的移植治疗,能够改善老年猕猴胸腺及脾脏组织的结构和功能。

脐带间充质干细胞临床研究的伦理与安全问题

脐带间充质干细胞（UCMSC）在临床上可用于各种涉及细胞变性、坏死或缺失的组织损伤、退变、自身免疫及炎症性疾病的治疗。由于UCMSC来源于新生儿脐带，属于废弃物，用于疾病治疗安全性较高，没有明显免疫排斥反应，伦理争论较少。

骨髓间充质干细胞修复辐射造血损伤的机制

背景:骨髓间充质干细胞与造血干细胞共移植,可提高辐射损伤的生存率。目的:对骨髓间充质干细胞在辐射损伤后造血重建及免疫调节方面的研究机制作一综述。方法:以"mesenchymalstem cells,radiation,radiation injury,hematopoietic stem cells,hematopoietic reconstitution,immunomodulatory"为关键词,应用计算机检索Web of science数据库2005到2016年的文献,选择性纳入与文章主题密切相关的文献。结果与结论:骨髓间充质干细胞能通过自噬及快速启动HR/NHEJ途径修复DNA断裂双键,通过细胞间相互作用、旁分泌作用保护与支持造血干细胞,通过抑制炎症与免疫反应维持造血微环境稳态,有效修复电离辐射导致的造血损伤。所以间充质干细胞可能有资格作为辐射导致的造血损伤的有效治疗手段。

多次贴壁法高效制备人脐带间充质干细胞

目的建立一套简单、高效、稳定、规范的人脐带间充质干细胞体外制备与鉴定技术,为人脐带间充质干细胞库建设及临床应用提供技术规范。方法改进前期技术方法,重复验证,建立规范化技术方法。无菌采集足月剖宫产分娩胎儿脐带,采用不剥离血管和包膜组织贴壁法培养脐带间充质干细胞。待原代细胞长出时,收集原本换液应丢弃的组织块,进行二次贴壁培养,如此反复,待二次贴壁组织块长出细胞时,收集组织块进行三次贴壁培养。对三次贴壁培养长出的第三代细胞进行生物学特性分析。结果首次组织贴壁后10～12 d可见成纤维样细胞从组织块爬出,二次、三次贴壁后第2 d就可见成纤维细胞样细胞爬出,且生长状况好,细胞形态更为均一。三次贴壁培养的第三代细胞都高表达CD29、CD44、CD90和CD105,不表达CD34和CD45。细胞生长曲线呈＂S＂型,均具有成脂、成骨、成软骨分化的能力。结论采用多次贴壁法制备的人脐带间充质干细胞充分利用了脐带组织块,且得到的原代细胞数量翻倍,其生物学特性稳定。

冻存脐带间充质干细胞的临床前制备

目的将冻存的人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)制备成一种复苏后可直接用于临床的制剂,并进行质量检定。方法从种子细胞库复苏冻存的UC-MSCs,待细胞培养至P3代时,收集UC-MSCs,按照4×107/剂的规格加入含5%人血白蛋白、10%DMSO、85%复方电解质溶液的细胞保护液,形成制剂,并对其进行质量检定,包括无菌检测、支原体检测、细胞内外源致病因子检测、内毒素检测、免疫表型检测、稳定性检测、异常免疫学反应检测以及残留物检测。结果制备的UC-MSCs制剂无菌、无支原体污染,无内外致病因子,毒素<2 EU,能抑制异源淋巴细胞的增殖,抑制率随脐带间充质干细胞数量增加而增大。牛血清残留<50 ng/袋,制剂冻存前细胞活性>90%,复苏后活性>85%。结论按照此方法制备的UC-MSCs制剂符合临床治疗要求的质量检定标准。

脐带间充质干细胞对体外外周血单核细胞的影响

目的观察脐带间充质干细胞(UC-MSC)对体外外周血单核细胞的影响。方法分离人UC-MSC和外周血单核细胞,流式分析技术鉴定单核细胞CD45和CD3的表达率;UC-MSC和单核细胞按不同比例共培养72 h,采用免疫荧光染色和ELISA方法检测γ干扰素(IFN-γ)在细胞内和培养上清的表达。结果采用含10%血清的DMEM/F12可以从新鲜脐带分离到UC-MSC,密度梯度离心法可以从外周血中分离到单核细胞,CD45阳性率为89.4%,CD3阳性率为80.7%。可在CD3/CD28刺激培养的单核细胞检测到IFN-γ的表达,1∶10和1∶20共培养上清IFN-γ的含量显著低于仅有单核细胞的对照组(P<0.01)。结论UC-MSC的存在可以影响IFN-γ在单核细胞的表达,这种影响与两种细胞的比例有关。

人脐带间充质干细胞体外规模化、标准化制备技术研究

目的建立人脐带间充质干细胞标准化、规模化制备技术。方法在无菌条件下，采集剖腹产婴儿脐带30条，长40-50cm，弃被膜、血管后，剪成1mm3的组织块，置于含10％胎牛血清的DMEM／F12的培养瓶中进行组织块反复贴壁培养，采用倒置相差显微镜动态观察细胞的生长及形态，对传代培养的第3代细胞采用流式细胞分析法进行细胞周期及表形分析，采用体外定向诱导分化实验观察多向分化潜能。结果组织块贴壁后于第4d开始向周围呈放射状长出细胞，平均12d左右长满瓶底，细胞形态呈均一梭形；传代培养后生长快速，于4—5d达80％融合；连续传代3次，其生长特性和形态不变，CD90、CD29阳性率〉99％。CD105阳性率〉81％，不表达CD34，CD45，在体外能分化成骨、软骨、脂肪细胞。平均每条脐带获得细胞数〉6×10^9个。结论通过多条人脐带重复分离培养，建立了体外规模化、标准化的人脐带间充质干细胞的制备与鉴定技术规范及标准。可为人脐带间充质干细胞库建设和临床应用提供技术支持和标准化脐带间充质干细胞。

成体干细胞治疗老年退行性疾病的可行性研究

衰老是生命发展的自然规律和现象．是由于身体细胞群长期受到体内外环境因素的冲击和伤害，引起身体各个组织器官结构与功能逐渐退化，并导致组织或器官功能减退的一种慢性综合性征[1]。老年退行性疾病是指那些与年龄相关的组织细胞老化导致的组织器官结构与功能减退．表现为器官功能障碍，身体抵抗力衰弱，协同功能丧失。

DC-CTL免疫细胞对4种恶性肿瘤治疗疗效观察

目的初步观察自体DC-CTL免疫细胞回输对4种恶性肿瘤治疗的临床疗效。方法 50例肿瘤患者分为4组,乳腺癌组12例,肺癌组27例,结直肠癌组8例,卵巢癌组3例。分离患者外周血单个核细胞(PBMC),分别诱导培养细胞毒T淋巴细胞(CTL)、树突状细胞(DC),诱导培养细胞达足够数量后回输给患者。分别在治疗前后采用流式细胞术检测患者外周血淋巴细胞CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+和肿瘤标志物的变化,采用主观问卷调查对卡氏行为能力(KPS)进行评分,并对治疗疗效进行评价。结果治疗1个月后,总有效率达82.0%,且未见明显副作用。治疗后1 w,各组外周血CD3、CD4、CD8均显著升高(P<0.05),而CD4+/CD8+无显著变化;各组外周血NK、CIK和KPS评分均显著升高(P<0.05),而CEA、FRP、CA19,CA153均较治疗前明显下降(P<0.05)。结论自体免疫细胞治疗对改善恶性肿瘤患者生活质量,提高患者的免疫功能有明显作用,且安全性好,为恶性肿瘤的治疗提供了一个新的方向。

鸡卵清提取液促进C57小鼠骨髓间充质干细胞增殖的研究

目的研究鸡卵清提取液是否有促进间充质干细胞增殖的作用。方法分离培养C57小鼠骨髓间充质干细胞,并用细胞增殖检测试剂盒检测培养基、PBS、HBSS和鸡卵清提取液不同终浓度、不同培养时间对细胞增殖的作用。结果鸡卵清提取液在不同终浓度、培养不同时间条件下,对细胞的促增殖作用都大于培养基、PBS和HBSS。结论鸡卵清提取液能促进C57小鼠骨髓间充质干细胞增殖。

干细胞治疗技术研究与实践

利用干细胞（stem cell,SC）的自我更新和多向分化特性来治疗损伤、退变性疾病是医学发展的新方向。SC可来源于早期胚胎和成体组织,还可通过体细胞核移植、基因导入及生物活性因子诱导等方式获得[1]。不同来源的干细胞具有共同的生物特性,但在分化潜能上有一定差异。胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）具有强大的可塑性，但涉及临床应用尚存在伦理、安全及技术问题。

干细胞技术平台建设与发展

针对临床治疗和军事医学需要,建成基础与临床紧密结合的干细胞技术平台,探讨了平台利用与发展模式,建立了一套可持续发展的运行机制,建成了国家、地方干细胞工程技术及转化医学重点实验室。针对干细胞治疗损伤和退变性疾病开展技术研究,获得国家和地方重大科技专项支持,取得了一批具备转化应用条件的成果,培养出了一个具有军地特色的省、市干细胞治疗技术创新团队。目标是创建再生医学研究与应用示范基地,实现干细胞技术在军事医学领域的转化应用。

人脐带间充质干细胞制剂创制的关键技术研究

脐带间充质干细胞（human umbilical cordmesenchymal stem cells, HUC-MSC）来源于新生儿脐带，具有自我复制和多向分化能力，在体内外特定环境诱导下，可分化为骨、软骨、肌肉、肝、内皮和心肌等功能细胞。与骨髓和脂肪来源的间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSC）相比。HUC-MSC采一集方便、来源充足、可规模化、标准化生产与储存。无伦理学争论，是最具有产业化和临床应用前景的干细胞之一。

脐带间充质干细胞对胶质瘤细胞转移侵袭能力影响初探

目的观察人源脐带间充质干细胞(HUCMSC)对胶质瘤细胞株U87转移、侵袭能力的影响。方法建立细胞共培养体系,CCK8法、transwell法和Matrigel法分别检测HUCMSC与U87非接触共培养后,U87增殖、转移、侵袭能力变化。结果体外细胞共培养体系中,HUCMSC共培养U87组(实验组)比U87单独培养组(对照组)转移和侵袭能力都有显著提高(P<0.05),HUCMSC共培养对U87有促增殖作用。结论在体外共培养体系中,HUCMSC可能通过促进EMT转化而提高胶质瘤细胞株U87增殖、转移和侵袭潜能。因此,在HUCMSC的临床转化应用中,应该考虑其可能的促肿瘤作用。

无血清和有血清培养人脐带间充质干细胞的对比

背景:研究表明有血清培养体系存在若干风险和问题,比如免疫排斥、批次差异、病毒风险等,另外随着外泌体的发现和应用,无血清培养体系变得越来越重要。目的:系统比较人脐带间充质干细胞无血清培养体系与传统有血清培养体系的异同,为人脐带间充质干细胞的临床转化奠定基础和提供实验数据。方法:无菌条件下采集健康剖腹产足月儿脐带,组织块贴壁法培养人脐带间充质干细胞,从第1代开始有血清培养组用体积分数为10%胎牛血清培养,血清替代物组用体积分数为15%血清替代物培养。倒置显微镜观察其形态变化,流式细胞仪检测其表面标记物,CCK-8检测其增殖能力,诱导分化实验检测其多向分化潜能,Western Blot检测干性标志物oct4、nanog、sox2的蛋白水平。结果与结论:(1)倒置显微镜下观察可见血清替代物组人脐带间充质干细胞呈现较均一的漩涡状生长,胎牛血清组人脐带间充质干细胞随着细胞代数的增加逐渐出现细胞分化或者老化现象;(2)两种培养法培养的人脐带间充质干细胞均表达CD73,CD90和CD105,低表达CD34和CD45,二者无明显差异;(3)增殖能力上胎牛血清组优于血清替代物组;(4)两种培养法培养的人脐带间充质干细胞均具有成脂、成骨、成软骨诱导分化能力,二者无明显差异;(5)血清替代物组与胎牛血清组oct4、nanog的表达水平无显著差异,血清替代物组sox2表达水平高于胎牛血清组(P<0.05);(6)血清替代物培养的人脐带间充质干细胞符合间充质干细胞国际标准,血清替代物能够替代胎牛血清成为培养人脐带间充质干细胞的优选方法。

骨髓胚胎样干细胞体内重建dystrophin的表达

目的观察骨髓胚胎样干细胞体内再生dystrophin的可行性。方法采用SSP-PCR方法鉴定mdx小鼠的基因型。分离扩增人骨髓胚胎样干细胞,采用DIR标记后,注射细胞到mdx小鼠腹股沟三角皮下,采用活体成像法观察植入细胞的存活情况,采用免疫荧光染色法检测dystrophin的表达。结果杂合子鼠交配可以产生3个基因型的子代鼠,采用SSP-PCR可以鉴定出mdx小鼠基因型;采用无血清培养基可从骨髓中分离到表达SSEA-4和FZD-9的胚胎样干细胞,可在注射细胞的mdx小鼠离体后肢肌肉检测到明显的荧光信号,并在肌肉组织中检测到人dystrophin的表达。结论人骨髓胚胎样干细胞可在mdx小鼠体内存活并表达dystrophin。

干细胞转染CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒后化学发光成像

目的研究用化学发光成像的方法观察脐带间充质干细胞转染CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒后的情况,代替活体成像仪的可行性。方法用CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒转染树鼩脐带间充质干细胞,用最适浓度的嘌呤霉素筛选,存活的细胞用6孔板的3个孔培养,贴壁后,3个孔依次加入底物D-荧光素钾盐,用化学发光成像仪拍照,再用软件进行活体成像转换。将转染成功的细胞注入麻醉后的树鼩皮下,树鼩静脉注射底物。结果细胞加入底物后有生物发光,发光强度随底物作用时间延长而减弱。树鼩皮下也观察到发光细胞。结论 CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒能成功转染树鼩脐带间充质干细胞,转染成功的细胞用于动物模型治疗后,可进行活体成像,观察细胞在动物体内的分布。

体外诱导体细胞逆分化为多能干细胞及对老年猴的影响

目的探讨诱导自体外周血单个核细胞逆向分化为多能干细胞样细胞的方法及诱导细胞对老年猕猴衰老相关血液生化指标的影响。方法利用鱼卵母细胞提取物与体外共培养法诱导猕猴外周血单个核细胞转化为多能干细胞样细胞,采用静脉回输的方法,将该细胞回输给20～24周岁的老年猕猴,检测并比较回输前后猕猴的体重、血常规以及超氧化物歧化酶（SOD）等指标的变化。结果与自体诱导性多潜能干细胞回输前相比,回输后3个月,猕猴体重无明显变化,外周血中SOD的活力和血小板的数量显著升高,血Na＋、K＋、CO2、AG含量显著升高,肌酐、尿酸、LDL-胆固醇含量显著降低。结论鱼卵细胞提取物可诱导部分外周血单个核细胞逆向分化为多能干细胞样细胞,该细胞能够显著改善与衰老相关的血液生化指标。

UC-MSC治疗儿童造血干细胞移植后GVHD的疗效观察

目的观察脐带间充质干细胞(UC-MSC)治疗儿童造血干细胞移植后移植物抗宿主病(GVHD)的疗效。方法对1例造血干细胞移植后发生GVHD的患儿行UC-MSC治疗,共治疗7次,每次4×107个细胞(20 ml)。结果患儿在接受UCMSC治疗后获得部分缓解(PR)。结论 UC-MSC对治疗儿童造血干细胞移植后的GVHD具有一定的疗效。