硫酸酯化裂褶多糖的制备及其抗凝血活性

文中主要探究裂褶多糖硫酸酯化的制备工艺及其抗凝血活性。采用单因素实验、响应面法优化三氧化硫-吡啶法制备硫酸酯化裂褶多糖(S-SPG)的工艺,并通过APTT(活化部分凝血活酶时间)、TT(凝血酶时间)、PT(凝血酶原时间)经典凝血实验探究其抗凝血功能。结果表明:当三氧化硫-吡啶复合物与裂褶多糖的质量比为4、反应温度为70℃、反应时间为3 h时,S-SPG的取代度最高,为1.85。红外光谱和^(13)C核磁数据表明裂褶多糖成功引入了硫酸基团。抗凝血实验表明,裂褶多糖经硫酸酯化后具有较强的抗凝血活性,对APTT、TT具有延长作用,对PT无影响,且其抗凝活性与浓度、取代度呈正相关。取代度最高的S-SPG3具有最强的抗凝血活性,当质量浓度为0.2 g/L时,其APTT为184.35 s,是同质量浓度下S-SPG2的1.86倍、S-SPG1的2.49倍,其TT超过90 s。

MG-132提高TNFR-Fc融合蛋白在CHO细胞中表达的研究

目的:在不影响细胞活力的前提下,通过抑制人肿瘤坏死因子受体-Fc(TNFR-Fc)融合蛋白的降解,提高其在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的产量和质量。方法:通过在细胞培养过程中加入全蛋白质合成抑制剂Cycloheximide、溶酶体抑制剂Leupeptin、蛋白酶体抑制剂MG-132,验证TNFR-Fc融合蛋白在CHO细胞的降解途径;免疫印迹(Western blot)方法检测在细胞内TNFR-Fc融合蛋白的变化,酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测分泌表达的TNFR-Fc融合蛋白的含量。Protein A亲和层析纯化细胞培养液上清,高效液相色谱(HPLC)检测重组蛋白的纯度,并通过阻断肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导的L929细胞毒作用来检测纯化的TNFR-Fc蛋白的活性。结果:TNFR-Fc在CHO细胞内,经泛素蛋白酶体途径降解,稳定表达TNFR-Fc的CHO细胞培养过程中添加50μmol/L MG-132,可以使TNFR-Fc融合蛋白的分泌表达量提高42.35%,纯化后,二聚体比例提高28.60%,并且纯化后目的蛋白的比活性也增加。结论:在不影响细胞活力、蛋白质生物学活性的前提下,添加蛋白酶体抑制剂MG-132提高TNFR-Fc融合蛋白在CHO细胞中的表达量,为进一步研究从抑制蛋白质降解途径来提高重组蛋白在CHO细胞中的表达量提供了现实依据。