基于支持向量机的重组大肠杆菌产脂肪酶MAS1的发酵建模与优化

该研究以来源于海洋放线菌(Streptomyces sp.)W007脂肪酶MAS1为研究对象,将其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并优化了发酵条件。首先,通过单因素实验确定重组大肠杆菌表达脂肪酶的最佳诱导时间为对数生长后期,最佳异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为0.6 mmol/L,最佳诱导pH值为6.5,最佳诱导温度为20℃。然后,用R语言rsm包设计Box-Behnken试验,并在7 L发酵罐中进行发酵试验以得到Box-Behnken实验数据。最后,通过支持向量机(Support Vector Machines,SVM)-遗传算法(Genetic Algorithm,GA)计算得到重组大肠杆菌BL21(DE3)表达脂肪酶MAS1的最优发酵条件:IPTG浓度为0.65 mmol/L、诱导温度23℃、诱导pH值为6.7时,理论脂肪酶MAS1酶活力为2276.99 U/mL。在7 L发酵罐中,使用优化后的发酵条件进行重组大肠杆菌BL21(DE3)培养时,得到最大脂肪酶MAS1酶活力为2316.02 U/mL,比未优化之前(1733.33 U/mL)提高了33.61%。上述结果表明SVM-GA在重组大肠杆菌发酵条件优化方面具有较好的性能,为脂肪酶MAS1的高效制备提供了一定的研究依据。

绿藻来源光脱羧酶McFAP的挖掘及其中短链脂肪酸选择性脱羧机制研究

利用脂肪酸脱羧制备烃类生物燃料是开发可再生能源的有效途径.相比于传统化学法,生物酶法具备高效、能耗低及环境友好等优势,更具有工业应用前景.光脱羧酶(FAP)是一类专一性强,催化效率高,催化过程无需额外添加昂贵辅因子,仅需利用蓝光即可将脂肪酸转化为烷(烯)烃的光驱动酶,在烃类生物燃料的高效可持续生物合成领域具有应用潜力.目前已报道的有偏好催化C12-C20链长脂肪酸的光脱羧酶,但其底物选择性机制尚未被深入探究.本文挖掘了来源于绿藻Micractinium conductrix的光脱羧酶Mc FAP,并开展了异源表达及制备、酶学性质表征、催化特性及底物选择性机制等研究.利用全基因合成技术获得了来源于绿藻Micractiniumconductrix假定的光脱羧酶基因序列mcfap,同时构建了N端缺失突变体Mc FAP-S(缺失1-550位氨基酸).在大肠杆菌中实现了Mc FAP-S的异源表达.重组的Mc FAP-S对链长为6-18的饱和直链脂肪酸均有脱羧活性,偏好中链脂肪酸,最适底物为正辛酸(C8:0)(转化率>99%).相同条件下,Mc FAP全细胞催化软脂酸(C16:0)脱羧的转化率是Cv FAP(来源于Chlorella variabilis)的1.7倍.重组的Mc FAP-S催化正辛酸脱羧的最适反应温度为40℃,孵育6 h后残余酶活力为70.2%;最适p H值为8.0,孵育5 d后残余酶活力为65.4%;对甲醇,DMSO等有机溶剂及Ni^(2+),Ca^(2+)等金属离子具有良好的耐受性;4℃避光条件下储存10 d残余酶活力为76.7%.考察了不同波长光对Mc FAP-S酶活力的影响,结果表明,红光照射3 h后Mc FAP-S残余酶活力为97.2%;在可见光照射下Mc FAP-S与正辛酸共孵育3 h后残余酶活力>99%.Mc FAP-S在30°C,p H 9.0,加酶量为60μmolL-1的条件下催化正辛酸脱羧,反应30 min后转化率为95.3%.构建了Mc FAP-S三维结构模型,通过与Cv FAP的三维结构对比分析,推测底物通道口大小对Mc FAP-S底物选择性有重要影响,根据二者对不同链长底物结合位置的区别,设计了突变体S338V,S338L,S338A,L339I,T340A,T340S,Mc FAP-S338A/L339I/T340S及?344-347.结果表明,S338L仅保留催化软脂酸脱羧活力(是野生型的3.7%);L339I对正庚酸(C7:0)脱羧活力相较于野生型降低了15%,对月桂酸(C12:0)脱羧活力增加了28%;T340S对正己酸(C6:0)脱羧活力降低了67%;S338A/L339I/T340S对正己酸脱羧活力降低了78%.以上表明,S338,L339,T340可能是参与该酶底物选择性调控的关键位点.综上所述,相较已报道的Cv FAP催化特性,Mc FAP具有偏好中链脂肪酸和脱羧活性更高等优势,提高光脱羧酶催化中链脂肪酸脱羧生成C5-C12烷烃的效率,同时本研究初步阐明了Mc FAP的底物选择性机制,可为光脱羧酶的研发及应用提供借鉴,为阐明光脱羧酶的结构功能关系研究提供一定的基础.

甘油二酯微胶囊中油脂的酶法提取

甘油二酯微胶囊是一种新型功能性食品配料,为准确测定其所包埋油脂的含油量、过氧化值、甘油二酯含量等理化指标,需建立其油脂组分的最适提取方法。本研究使用酸水解、碱水解、超声处理和菠萝蛋白酶水解4种方法对亚麻籽二酯油微胶囊进行破壁预处理,对比了不同预处理方法对微胶囊中油脂提取效果的影响,即考察了油脂提取率和油脂的过氧化值,通过高效液相色谱法分析了所提取油脂的甘油酯组成。结果显示:菠萝蛋白酶水解法预处理后提取得到的油脂过氧化值最低,其中的甘油二酯损失最少;酸水解法和超声处理法得到的油脂提取率较高,但酸水解法处理后油脂中的甘油二酯含量损失最多,超声处理后得到油脂的过氧化值最高;碱水解法处理后的油脂提取率最低。在酶水解法单因素实验的基础上进行正交试验,探究酶添加量、酶解温度和酶解时间对油脂提取率的影响,并优选了酶解处理后的萃取溶剂。结果表明:当菠萝蛋白酶的加酶量为12000U/g、酶解温度为55℃、酶解时间为5min时,甘油二酯微胶囊的油脂提取率可达(98.60±0.78)%,油脂过氧化值为(0.037±0.001)g/100g。酶解后最佳萃取体系为乙醇-乙醚-石油醚(体积比为2∶5∶5)。该方法的油脂提取率高,对油脂品质影响较小,为甘油二酯微胶囊的理化性质检测提供了理论基础。

椰子油基酸奶的品质及体外消化特性研究

为开发新型酸奶,给消费者提供更多的选择,以脱脂奶粉、水、椰子油为原料,经高速剪切、高压均质制备富含椰子油的复原乳,再经灭菌、冷却、接种、发酵后制得椰子油基酸奶。探究了椰子油添加量(0%、2%、4%、6%、8%、10%和12%)对复原乳粒径的影响,对酸奶酸度、色度、持水性、感官特性、质构特性的影响,并研究了感官得分最高的椰子油基酸奶的消化特性。结果表明:椰子油添加量在2%~8%时,复原乳的平均粒径和粒径分布均无显著性差异;椰子油添加量为6%时,酸奶感官评分最高,为89.1分,此时酸奶的持水力为87.1%、pH为4.25、色度L*为89.42;体外肠消化模拟实验证明,椰子油基酸奶(椰子油添加量为6%)的甘油三酯水解率及脂肪酸释放率分别比相同含油量的传统酸奶高25.99%及13.85%。综上,添加椰子油有利于酸奶的消化吸收,且椰子油添加量为6%时制得的酸奶整体品质最好。

国内外米糠油品质的研究

旨在改善国内市售米糠油品质,选取11种国内外来源的米糠油,对其基本理化性质、脂肪酸及甘油酯组成、生物活性成分及有害物质含量进行测定。结果表明:不同来源的米糠油酸值、过氧化值、色泽等基本理化指标均符合国标限定要求;不同来源米糠油脂肪酸组成差别不大,甘油酯组成差异明显;不同来源米糠油中生物活性成分含量差异较大,谷维素含量在3200~26000 mg/kg范围内,植物甾醇含量在224~5197 mg/kg范围内,生育酚含量在35~400 mg/kg范围内,角鲨烯含量在1~12 mg/kg范围内;不同来源米糠油塑化剂及苯并(a)芘含量均符合国标限定要求,然而国产的米糠油中3-氯丙醇酯及缩水甘油酯含量远超欧盟标准。国内米糠油加工企业应改进生产工艺,减少精炼过程中氯丙醇酯及缩水甘油酯的生成。

不同壁材组合对三丁酸甘油酯微胶囊性质的影响

为拓宽三丁酸甘油酯的应用范围,以三丁酸甘油酯为芯材,抗性糊精-明胶-海藻酸钠(RGS)、抗性糊精-明胶-海藻酸钠-月桂酸单甘酯(RGSG)、抗性糊精-明胶-壳聚糖(RGC)、抗性糊精-明胶-壳聚糖-月桂酸单甘酯(RGCG)为壁材,采用喷雾干燥法制备4种微胶囊,对微胶囊包埋率及产率、粒径分布、基本理化性质、颜色、结构特征及外观形貌进行分析,探究不同壁材对三丁酸甘油酯微胶囊性质的影响。结果表明:RGSG微胶囊包埋率(91.05%)及产率(90.46%)较高;与RGC、RGS微胶囊相比,RGSG、RGCG微胶囊的水分活度、粒径分布、流动性、吸湿性、亮度均有一定的改善;红外光谱及扫描电镜结果表明三丁酸甘油酯被壁材有效包埋起来,其中RGSG、RGCG微胶囊形成了更强的氢键。综上,RGSG制备的微胶囊综合性质优于其他3种壁材。

天然抗氧化剂对亚麻籽甘油二酯油氧化稳定性的影响

为提高亚麻籽甘油二酯油的氧化稳定性,研究了抗坏血酸棕榈酸酯、迷迭香提取物和维生素E及其组合对亚麻籽甘油二酯油的抗氧化作用。以氧化诱导时间为响应值,在单因素实验基础上,通过响应面分析确定最优的抗氧化剂组合。考察了优化的抗氧化剂组合对亚麻籽甘油二酯油高温加热时反式脂肪酸含量的影响。结果表明:相较于单一的维生素E、迷迭香提取物和抗坏血酸棕榈酸酯,三者组合能显著提高亚麻籽甘油二酯油的氧化稳定性;最优抗氧化剂组合为抗坏血酸棕榈酸酯添加量84 mg/kg、迷迭香提取物添加量405 mg/kg、维生素E添加量1808 mg/kg,在此条件下亚麻籽甘油二酯油的氧化诱导时间为11.13 h,是空白对照的6.79倍;该抗氧化剂组合能抑制油中反式脂肪酸的生成。天然抗氧化剂绿色、安全,可有效提高亚麻籽甘油二酯油的氧化稳定性。