广东省猪圆环病毒2型毒株分离及全基因序列分析

为了解广东省猪圆环病毒2型（PCV2）的流行、变异及进化情况,对2013年广东省多个猪场发生PCV2感染的病猪血清进行PCV2病毒分离,参考GanBank上已发表的PCV2全基因序列,设计3对引物,用PCR方法扩增其全基因序列,测序并进行序列分析.结果分离到9株PCV2毒株,全基因序列长度都为1 767 bp.同源性分析表明,9株PCV2分离株核苷酸同源性为93.6％～99.4％,与2012年分离株同源性为94.5％～99.7％,与2011年分离株同源性为94.2％～99.7％,与GenBank中其他PCV2分离株的同源性为93.2％～99.7％.9株PCV2的ORF2核苷酸及其推导的氨基酸序列同源性分别为89.0％～99.9％和86.4％～ 100％,存在一定的变异.基因型分析表明,有5株属于PCV2d,3株属于PCV2b,1株属于PCV2a.对2011-2013年分离的PCV2基因组特征进行分析,发现PCV2核苷酸序列比较稳定,与世界其他分离株也具有较高的同源性.

广州市罗非鱼源无乳链球菌分离鉴定与致病性研究

从广州增城中新镇发病罗非鱼体内分离到4株致病菌株,经细菌形态学观察、生化试验鉴定、特异基因cfb扩增及序列分析,初步鉴定为罗非鱼无乳链球菌。4株无乳链球菌均对头孢哌酮、庆大霉素、先锋霉素Ⅴ、先锋霉素Ⅵ、阿奇霉素、克林霉素、头孢孟多等敏感。选用其中的ZX1分离株分别对罗非鱼、小鼠、乳鼠进行人工感染,结果显示,用活菌数为109个/mL的菌液腹腔注射罗非鱼,可使受感染鱼100%死亡;用活菌数为108个/mL的菌液腹腔注射小鼠和皮下注射乳鼠,在72 h内的死亡率为分别为66.7%和100%;表明分离株ZX1对罗非鱼和小鼠具有较强的致病性。经多重PCR检测分离株分子血清分型,结果显示分离株均为Ⅰa型。

CRISPR-Cas基因组改造技术研究进展

CRISPRs-Cas系统是一种细菌获得性免疫系统,为一段规律成簇间隔短回文重复,保护细菌和古生菌免遭病毒、质粒等的入侵。这种免疫系统是由一种小RNA和多结构域蛋白质/蛋白复合物构成,其作用机理可能与真核生物的RNA干扰过程类似。这个系统已发展为一种高效、特异、操作简单易行的基因修饰工具,与TALEN、ZFN相比,CRISPR-Cas系统的出现使得基因编辑变得更加有效和简易,具有更大的潜力。CRISPR/Cas系统已成功应用到细胞、干细胞、小鼠、斑马鱼及植物等多种生物,显示了其强大的基因编辑优点。综述了CRISPR-Cas系统的技术原理及其在生物学研究中的应用最新研究进展,并探讨了该技术的发展前景。

间接ELISA与中和试验检测O型FMDV疫苗免疫猪血清抗体的比较研究

血清中和抗体滴度的高低,体现了血清对病毒感染的中和能力,是评价疫苗免疫效果的重要指标。对国内3个大型猪场共120头猪的血清样品分别进行O型口蹄疫病毒ELISA和病毒中和试验,并分别比较两种方法的符合率和阳性检出率。结果表明,两种方法的阳性符合率和阴性符合率分别为77.3%和72.2%,总符合率为75%,均能有效检测猪血清中的口蹄疫抗体水平,但是采用间接ELISA检测血清抗体,存在一定比例的假阳性或假阴性。病毒中和试验更适合进行口蹄疫血清学的检测。

兽用抗生素加米霉素研究进展

加米霉素(Gamithromycin)是一种新型的半合成大环内酯类(Marolides)兽用抗生素,通过抑制细菌RNA依赖性蛋白合成而起到抑菌和杀菌的作用。加米霉素对引起牛呼吸系统疾病(BRD)的溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌及牛支原体等均有较高的抗菌活性,其动力学特点优良,吸收快,达峰时间短,生物利用度较高,可以在肺组织达到较高的组织浓度;加米霉素毒性低,在动物的可食性组织中残留较少,治疗无副作用,国外已广泛应用于牛的呼吸系统疾病临床治疗。因此,在我国兽医临床上具有广阔的应用前景。为了促进其在我国兽医临床上的合理应用、研制与开发,现对其抗菌活性、药动学、毒性及残留、临床应用等相关研究进展进行综述。

82种中草药对罗非鱼无乳链球菌的抑菌活性研究

采用琼脂扩散法的牛津杯法,测定82种中草药水提物对罗非鱼(Tilapia sp.)无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的体外抑菌活性,并采用纸片法选择几种活性较强的中草药水提物对无乳链球菌进行联合药敏试验。结果显示,黄连、五倍子、红藤、大蒜、北五味子、夏枯草、艾叶、苏木、三棵针、紫苏、土槿皮、老鹤草、石榴皮、大黄、丹参、鱼腥草、虎杖、赤芍、车前草、田基黄20种中草药水提物对无乳链球菌表现出明显的体外抑菌活性,其中黄连、五倍子的体外抑菌效果最显著;中草药联合药敏试验结果表明,五倍子与大黄、艾叶、丹参、苏木、北五味子、红藤、石榴皮、虎杖、黄连表现为协同作用;黄连与大黄、丹参、苏木、红藤表现为协同作用,与艾叶、北五味子、石榴皮表现为拮抗作用;三棵针与大黄、丹参、苏木、红藤、石榴皮、黄连、夏枯草、五倍子表现为协同作用,与艾叶、北五味子、虎杖表现为拮抗作用。

3株柔嫩艾美耳球虫野外分离株的药物敏感性试验研究

为探讨不同野外分离株柔嫩艾美耳球虫的药物敏感性,以广东三水、从化、高明等地区所分离的3株柔嫩艾美耳球虫为研究对象,分别选取尼卡巴嗪、癸氧喹酯、氯苯胍、球痢灵等4种常用抗球虫药物进行药物敏感性试验,通过最适抗球虫活性百分率(POAA)、病变计分减少率(RLS)、相对卵囊产量(ROP)和抗球虫指数(ACI)等4项指标综合判定药物敏感性。结果显示,尼卡巴嗪对三水株的RLS为77.27%,对从化株的POAA为83.63%,判为抗药,对高明株的RLS和ACI分别为64.06%和160.63,判为部分抗药;球痢灵对高明珠的POAA为51.02%,判为抗药;而癸氧喹酯、氯苯胍、等抗球虫药对于3株野外分离株均为完全抗药。结果表明所分离虫株已形成严重抗药性,该地区所暴发的球虫病应选用尼卡巴嗪的复方,同时给予合理的用药程序。

携带FMDVDNA疫苗重组减毒沙门氏菌的构建及其安全性和稳定性研究

为探讨携带FMDV DNA疫苗重组沙门氏菌口服免疫可行性,PCR扩增O型FMDV主要抗原基因VP1,并连接到真核表达载体p IRES,将构建的质粒p IRES-VP1体外转染BHK-21细胞,间接免疫荧光检测VP1基因的表达。通过氯化钙转化法将重组质粒p IRES-VP1转入减毒鼠伤寒沙门氏菌2266,构建2266(p IRES-VP1)重组菌,并以108、109、1010CFU的剂量口服免疫小鼠,2周后以相同剂量加强免疫,以研究重组菌在小鼠体内的稳定性及安全性,并通过将重组菌进行体外传代,研究重组质粒在体外的稳定性。研究结果表明:108、109CFU剂量免疫小鼠成活率为100%,1010CFU剂量口服小鼠出现扎堆现象,且行动迟缓。重组菌体外连传8代以及免疫小鼠后从脾脏和肝脏分离鉴定表明,重组菌2266(p IRES-VP1)在体内和体外均具有较好的安全性和稳定性。

TALEN靶向基因修饰新技术研究进展

靶向基因敲除基因修饰TALEN(Transcription Activator-Like(TAL)Effector Nucleases),是一种崭新的分子生物学工具,被《Science》选为2012年年度十大科学突破的新技术。该技术通过构建与核酸内切酶的融合蛋白,在特异位点打断目标基因DNA序列,从而可在该位点进行DNA编辑修饰操作,如knock-out、knock-in、碱基替换、点突变或基因修饰等。TALEN技术与以往技术相比更经济、更有效,已经成功应用到了细胞(干细胞、诱导性多功能干细胞iPS)、酵母、斑马鱼、大鼠、小鼠及植物等各类模式生物上,此项技术定会带来新的实验理念与思路。综述了TALEN的技术原理和应用。

2014—2016年广东省PRRSV GP5基因遗传变异分析

为监测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的遗传变异情况,采集了2014—2016年间广东地区46个猪场317份疑患PRRS的临床样品进行检测,并对阳性样品的GP5基因进行了RT-PCR扩增、克隆和测序,选出21株PRRSV GP5基因进行序列比对和遗传进化分析。结果表明：所分离的PRRSV均属于美洲株,21株PRRSV GP5基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为82.4%-98.7%和78.6%-98.5%,其中2株与美国NADC30分离株同属亚群Ⅲ,10株与近几年广东省内分离的PRRSV毒株QYYZ和GM2同属于亚群Ⅳ。PRRSV GP5基因的遗传进化分析结果表明,亚群Ⅲ和亚群Ⅳ是近几年在广东省内流行的新兴亚群,研究结果将为PRRSV疫苗的选择以及防控方案的制定提供参考。

猪蓝耳病病毒分离纯化及Nsp2序列分析

对广东省几个地区发生疑似PRRSV感染的猪场送检的502份血清进行RT—PCR检测。将检测到的阳性血清接种到Marc-145细胞上并连续传代4～5次．收获出现明显细胞病变（CPE）的样品，利用蚀斑试验克隆纯化PRRSV。根据高致病性PRRSVNsp2基因缺失区的两端保守区设计了1对引物区分经典PRRSV和高致病性PRRSV。研究结果表明，成功分离到12株PRRSV并纯化出2株病毒。从502份血清样品中检测到156份阳性血清，PRRSV感染阳性率达32％，经鉴定均为高致病性PRRSV变异株。对分离毒株的Nsp2基因序列进-步分析，发现此次分离株Nsp2基因与VR-2332株（70．7％-74．6％）的核苷酸同源性较JXAl株（87．1％-100％）偏低；在系统进化树上分离株与JXAl变异株亲缘关系比较近，而与VR-2332株亲缘关系比较远。说明广东省地区普遍存在PRRSV的感染．并且病毒出现了不同程度的变异。

HRM分析方法中不同扩增片段、染料和仪器的比较

高分辨率熔解曲线技术(High resolution melting,HRM)是近年发展起来的基于实时荧光定量技术分析核苷酸突变而进行基因分型的一种新型技术。比较了几种动物疫病病原(猪瘟病毒、禽白血病病毒、鸡艾美耳球虫株)的不同扩增片段(C202、ALV450、En573和C965)、不同荧光染料(LC Green、SYTO9和SYBR GreenⅠ)和不同仪器[Light Scanner96(Idaho),Light Cycler480(Roche)和Rotor-Gene Q(Qiagen)]在HRM基因分型上的异同,揭示了HRM技术对病原体进行分型时,不同扩增片段和不同性质荧光染料对其分型结果影响较大:拥有多个熔解区间的核酸序列比单独1个SNP位点特异性高,更适合于分型;核酸相邻熔解区间Tm差值影响实际HRM分型结果;饱和荧光染料(LC Green和SYTO9)比非饱和染料(SYBR GreenⅠ)分辨率更高,更适合用于HRM分析,并且不同浓度荧光染料对Tm值有一定的影响;不同HRM仪器之间HRM结果无明显差异。

绿色木霉固体发酵前后2种黄酮类成分含量变化

目的研究枫蓼药材经绿色木霉发酵后2种黄酮成分含量变化。方法利用高效液相检测法,经绿色木霉发酵216 h时枫蓼药材中2种黄酮成分的含量,并与发酵前相比较,计算各成分的含量变化。结果经绿色木霉发酵能增加槲皮素的含量,至发酵时间72 h槲皮素含量达到最大值(318μg·g^(-1)),为发酵前的152%。结论利用绿色木霉发酵后,可使枫蓼药材中槲皮素含量增加,且发酵时间72 h为最佳。

高效液相色谱法同时测定水辣蓼提取物中6种黄酮成分的含量

建立了同时定量检测水辣蓼中6种黄酮类成分的高效液相色谱方法：选择Waters Symmetry shield RP18（4.6 mm×250 mm,5.0 μm）色谱柱,流动相甲醇-0.4％甲酸水溶液（梯度洗脱）,流速1 mL/min,柱温30℃,检测波长359 nm,进样量10 μL.结果表明,6种黄酮成分在50 min内达到基线分离,在0.1～20μg/mL浓度范围内,6种黄酮成分的线性相关系数R2≥0.9995,平均加样回收率为96.65％～99.54％,RSD为0.82％～ 1.38％ （n=3）.该方法准确、简便,重复性好,可用于水辣蓼中芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、异鼠李素和山奈酚的含量测定,为控制水辣蓼药材的质量提供依据.

冷鲜鸡产气荚膜梭菌及其毒素的潜在危害分析

为调查广州市冷鲜鸡产气荚膜梭菌及其毒素危害,从广州市各大型超市随机采集鸡肉样品进行产气荚膜梭菌分离、鉴定和毒素分型,同时检测分离菌株对常用抗生素的抗药性,并采用Eric-PCR对分离出梭菌进行亚型分析。结果表明,从78个样本中分离出57株产气荚膜梭菌,所有菌株均为A型,其中,cpb2(Atypical)型40株,cpb2(consensus)型1株;含net B基因菌株1株;药敏结果显示,分离出的产气荚膜梭菌大部分对氟苯尼考、氨苄西林、青霉素敏感;值得注意的是产气荚膜梭菌分离株对仅可用于人的抗生素克林霉素、头孢氨卞的耐药率分别达73.68%和31.58%。Eric-PCR结果显示,相似性为80%时,57株梭菌可分为13个亚型,提示污染来源的多样性。

强鸡散对免疫抑制小鼠脾转录因子GATA-3和T-bet表达量的影响

试验旨在通过定量检测小鼠转录因子T-bet、GATA-3 mRNA表达水平,探讨强鸡散对环磷酰胺致免疫抑制小鼠转录因子GATA-3和T-bet的调节作用。40只体重20 g左右的昆明纯种小鼠被随机分为4组:环磷酰胺组、中药组、环磷酰胺+中药组、对照组,采用实时荧光定量PCR方法,以β-actin基因作为内参基因,检测T-bet和GATA-3 mRNA的表达量。结果显示:强鸡散能改变小鼠脾脏转录因子GATA-3的相对表达量,对T-bet基因表达量没有明显影响。表明强鸡散具有调节环磷酰胺致免疫抑制小鼠脾脏转录因子GATA-3和T-bet表达量的作用,通过降低GATA-3的表达量,间接减少Th2细胞的生成,使Th1/Th2平衡向Th1方向转化。

华南地区猪流行性腹泻病毒的分子流行病学调查与分析

为了解华南地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行、变异及进化情况,从该地区的不同猪场采集2 159份样品,利用RT-PCR方法检测PEDV,扩增了部分PEDV阳性样品中的S、M和ORF3基因并测序,利用生物信息学软件进行序列分析。结果显示,PEDV在猪场中的检出率为100%,在所有样品中的平均检出率为53.0%,在哺乳仔猪、断奶仔猪、育肥猪和母猪样品中,PEDV平均阳性率分别为67.6%、42.8%、12.8%和47.2%。根据S、ORF3和M基因建立的进化树,PEDV可分为2个基因群,其中当前样品株为一群,韩国、美国和中国的参考毒株为一群。结果表明,PEDV在华南地区猪场普遍存在,其基因也在不断发生变化。

2010—2013年华南地区猪流行性腹泻病流行情况调查及防控效果

2010年底至今,华南地区暴发了严重的高死亡率猪流行性腹泻病(PED),为了解该地区发病猪场PEDV的感染情况,应用PED胶体金检测试剂盒和RT-PCR检测方法测定了不同地区60家发病猪场的粪便样品。结果显示,60个猪场中,PEDV阳性率为100%,不同规模猪场平均死亡率为76.87%;该病一年四季均可发生,但冬春季节高发;采取免疫组织灭活苗和返饲方法在一定程度上能够有效控制PED的发生和流行。

实时荧光技术在鸭坦布苏病毒RT-LAMP检测方法中的应用

由鸭坦布苏病毒(DTMUV)引起的蛋鸭产蛋急剧下降给我国的养鸭业造成了巨大的经济损失。针对DTMUV E基因保守区域设计一套LAMP引物,利用实时荧光技术建立了DTMUV的实时RT-LAMP病原检测方法。该方法检测RNA的最低检测极限可达到7.8 copies,其灵敏度是普通RT-PCR的100倍,且只能特异性扩增DTMUV的RNA,对其他常见鸭源病毒核酸均无特异性扩增。该方法简单快速、特异性强和灵敏度高,判定结果只需要观察扩增曲线,适用于DTMUV早期感染的诊断、分子流行病学调查和疫情监测。

1型鸭疫里默氏杆菌铁依赖抑制子RaDtxR全长基因的扩增及生物信息学分析

为了扩增1型鸭疫里默氏杆菌铁依赖抑制子基因(RaDtxR)全长序列,对SiteFing-PCR技术做了改良。改良后的SiteFinding-PCR技术更加简单、方便且省时。SiteFinding-PCR结果显示,获得的目的片段大小为937 bp,向前延伸了710 bp。RaDtxR全长基因序列为654个核苷酸,编码217个氨基酸。生物信息学表明,RaDtxR包含完整的铁离子依赖抑制子超家族保守结构域,在进化分类上更接近于白喉棒状杆菌毒素抑制子DtxR。同源建模表明,RaDtxR氨基酸序列含有典型的FUR/DtxR抑制子的HTH结构。