线粒体DNA缺失HepG2细胞系的建立、鉴定及放射生物学特性

目的为研究人肝癌细胞系Hep G2线粒体DNA(mt DNA)缺失后的放射生物学特性,建立并鉴定mt DNA缺失Hep G2(ρ0Hep G2)细胞系。测定辐射干预下mt DNA缺失(Rho0)肝癌细胞的凋亡情况、侵袭能力以及辐射敏感性的变化。方法在含有溴化乙锭(EB)、丙酮酸、尿嘧啶的特殊培养基中培养Hep G2细胞,经30次传代后,有限稀释法筛选完全去除mt DNA的克隆。去除丙酮酸及尿嘧啶后,观察细胞的存活情况。PCR法鉴定mt DNA的缺失。用6Mv X射线梯度剂量照射Hep G2细胞和ρ0Hep G2细胞,平板克隆法绘制生长曲线,线性二次方程拟合生存曲线,计算α/β。2Gy剂量辐射细胞,24 h后用Hochest33342细胞核染色,比较Hep G2细胞与ρ0Hep G2凋亡率的差异。用Transwell法测定两种不同细胞的侵袭能力。结果在含EB特殊培养环境下,Hep G2细胞可持续生长传代至30代,去除丙酮酸和尿嘧啶后,细胞短时间内大量死亡。经PCR法证实mt DNA完全缺失。ρ0Hep G2细胞α/β显著低于正常Hep G2细胞,辐射抵抗能力增强。辐射干预后ρ0Hep G2的凋亡比例显著减少。ρ0Hep G2穿膜细胞数显著增多。结论在EB长期诱导下,Hep G2肝癌细胞可被成功诱导为mt DNA缺失细胞。ρ0Hep G2细胞的辐射抵抗性显著增强,抗凋亡能力及侵袭能力均提高。

X线诱导肺腺癌SPC-A-1细胞发生Parthanatos

目的初步探讨X线诱导肺癌SPC-A-1细胞是否发生新的细胞死亡形式Parthanatos。方法以肺腺癌SPC-A-1细胞为研究对象,以1、2、4、6、8、10 Gy梯度剂量辐射细胞,平板克隆法测定X线辐射对人肺癌细胞SPC-A-1的半数致死剂量(LD50),WST-1法进行验证。LD50辐射细胞后4、8、12、24 h,RT-PCR法检测细胞AIF转录水平变化,Western blot检测细胞AIF蛋白表达变化,激光共聚焦观察细胞AIF向细胞核内转移情况,Western blot检测细胞辐射后不同时间AIF在线粒体蛋白组分和核蛋白组分中的分布变化。TUNEL法检测辐射后12 h细胞核DNA的断裂。结果 X线对SPC-A-1细胞的LD50大致为3 Gy。以3 Gy辐射细胞后不同时间AIF在转录、蛋白水平均无显著变化(P>0.05)。辐射后12 h AIF由线粒体向细胞核转位,伴随细胞核的溶解、碎裂。亚细胞组分Western blot检测到12 h后AIF在线粒体蛋白组分中显著下降,由对照组的1.12±0.15下降至12 h组的0.21±0.07(P<0.05),而在核蛋白组分中显著上升,由对照组的0.05±0.02上升至12 h组的0.45±0.07(P<0.05),同时在固缩的细胞核中检测到DNA的断裂。结论 AIF核转位参与了X线诱导的细胞凋亡过程。辐射后12 h AIF由线粒体向细胞核转位显著增多,导致细胞核固缩、碎裂、溶解,细胞发生了Parthanatos。

人线粒体DNA基因表达谱芯片的制备及鉴定

研制人线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)表达谱芯片,鉴定芯片的特异性和稳定性,完善芯片的制备和使用程序,优化实验参数,为线粒体功能研究提供物质基础及技术保障。以人mt DNA剑桥序列为标准,设计mt DNA编码的13种mRNA、2种rRNA和9种tRNA基因及蛋白产物定位于线粒体的核DNA(n DNA)编码的5种凋亡相关基因寡核苷酸探针。芯片点样仪点制芯片,进行荧光显示和洗脱,用其检测人宫颈癌上皮Hela细胞和人肾小管上皮Hc1细胞c DNA文库mt DNA编码基因及n DNA编码凋亡相关基因的差异表达情况。所点制的芯片扫描结果显示,样点分布均匀、清晰,规整度好,无漏点、连点。c DNA文库杂交鉴定结果显示,整张芯片荧光信号均匀一致,背景清晰,各基因重复样点杂交结果一致,各质控点能正常显示。成功制备了人mt DNA基因表达谱芯片,完善了该芯片的制备和使用程序,通过初步应用,证明所研制的人mt DNA基因表达谱芯片具有特异性高、稳定性好等优点,可用于不同组织或细胞样本c DNA文库mt DNA基因的差异表达分析。