采用噬菌体展示技术筛选肠致病性大肠埃希菌EspB蛋白结合短肽的实验研究

目的探讨是否能够通过噬菌体展示技术筛选与肠致病性大肠埃希菌(EPEC)关键蛋白EspB结合的短肽。方法采用体外大肠埃希菌中表达和纯化EspB蛋白情况,Western blot验证蛋白的表达;Ph.D.12-蛋氨酸噬菌体展示技术用来筛选EspB特异结合蛋白;ELISA方法用来鉴定这些特异性结合蛋白与EspB的亲和力。结果 Western blot验证从pET21b-EspB转染质粒中提取的EspB蛋白。噬菌体展示技术筛选出了噬菌体6、7、8、12候选蛋白,ELISA检测结果显示这些候选蛋白与EspB蛋白的亲和力高于对照蛋白。结论我们的数据提供了一种潜在的研究策略即通过靶向结合EspB蛋白可抑制EPEC对上皮细胞的粘附。

环丙沙星对肠致病性大肠埃希菌转录谱基因表达的影响

目的探讨不同浓度环丙沙星对肠致病性大肠埃希菌转录基因表达的影响。方法在肠致病性大肠埃希菌对数生长期加入不同浓度环丙沙星(高浓度组4μg/ml,低浓度组2μg/ml),对照组加入生理盐水,分别于0、45、90、135和180min时收集菌液,提取细菌总RNA,使用表达谱芯片检测环丙沙星作用后肠致病性大肠埃希菌在转录过程中的基因变化,分析各时间点大肠埃希菌转录水平差异;筛选差异基因,采用荧光定量PCR验证差异基因表达。结果与生理盐水组比较,4μg/ml环丙沙星组大肠埃希菌共有1 724个基因转录上调,1 806个基因转录下调,2μg/ml组中共有988个基因转录上调,2 297个基因转录下调。在表达差异的基因中,以编码假设合成蛋白及转录调控蛋白基因数最多。两组中有共性的基因为21个,这些基因在不同浓度及所有的5个时间点均下调表达,表达的基因包括编码ABC转运膜蛋白基因和菌毛蛋白基因。在2μg/ml与4μg/ml组的对比中,未观察到环丙沙星影响肠致病性大肠埃希菌致病岛毒力基因的表达差异(P>0.05)。差异表达的基因通过荧光定量PCR检测均有统计学意义(分别与生理盐水组比较,P<0.05)。结论不同浓度环丙沙星体外对肠致病性大肠埃希菌毒力基因转录的影响无显著性差别,但对耐药相关基因转录具有显著影响,这些影响是否与对肠致病性大肠埃希菌对环丙沙星耐药有关仍需进一步研究。

全基因测序分析粪肠球菌利奈唑胺耐药相关变异位点的研究

目的通过全基因组序列研究利奈唑胺敏感株和诱导耐药粪肠球菌之间基因位点差异,分析利奈唑胺耐药相关基因变异位点。方法粪肠球菌ATCC29212菌株用浓度梯度的利奈唑胺进行耐药性诱导,最终获得利奈唑胺耐药的粪肠球菌株LRS29212。提取其总DNA,进行PE(paired end或称双端)测序,采用软件SPAdes进行序列拼接,拼接获得原始scaffold,然后用Gapcloser及GapFiller对scaffold补Gap,采用PrInSeS-G进行序列校正,最终获得全基因组序列。获得的全基因序列与标准株ATCC29212菌株基因组序列(PUBMED公布序列)作比较,获得变异基因位点,并对变异基因功能进行注释。结果通过32代诱导,获得了粪肠球菌LRS29212,其MIC值为128μg/ml;粪肠球菌LRS29212全基因组包含3 010 552碱基对,GC含量37.3%。基因组通过注释后总共有2 918个编码序列(CDS),53个tRNA的编码基因,以及5个完整的rRNA基因编码的操纵子,获得PUBMED全基因序列号(PRJNA257022);总共找出152个SNP,其中错义突变的SNP有24个,包含结合糖ABC转运ATP结合蛋白。结论经LZD诱导成功获得耐LZD粪肠球菌LRS29212菌株,测序分析该菌株存在基因突变位点,为进一步研究LZD耐药机制奠定了基础。

双歧杆菌表达肠致病性大肠埃希菌EspA蛋白的体外研究

目的构建肠致病性大肠埃希菌(Enteropathogenic E.coli,EPEC)EspA蛋白双歧杆菌表达重组菌株,并验证蛋白表达。方法采用常规PCR扩增EspA片段,体外构建重组质粒pBAD-EspA,转化大肠杆菌BL21感受态细胞培养,挑取单克隆提取质粒,双酶切和PCR对重组质粒鉴定。pBAD-EspA电转化长双歧杆菌感受态细胞,挑取阳性克隆并PCR鉴定,经木聚糖诱导表达,蛋白质印迹试验(Western blot)分析验证EspA蛋白在双歧杆菌中的表达。结果经酶切后琼脂糖凝胶电泳及测序结果证明pBAD-EspA重组质粒构建成功。pBAD-EspA重组质粒转化双歧杆菌后经阿拉伯糖诱导,在诱导表达不同时间点菌液沉淀均有良好的蛋白表达。结论体外成功构建表达EPEC EspA蛋白的长双歧杆菌,为制备ESPA口服疫苗提供科学依据。

人I型干扰素受体亚基表达对IFN-α抑制HBV复制水平的影响

目的探讨人I型干扰素受体亚基(IFNAR1)不同表达水平对IFN-α抑制HBV复制的影响。方法扩增在前期构建的IFNAR1不同表达水平稳定Hep G2细胞(R1/H1、R1/H2、R1/H3株和对照细胞PS1、PGFP细胞),分别以瞬时转染HBV表达质粒pUC19-1.24HBV和对照质粒,培养24h后加入IFN-α,48h后收集细胞采用Southern blot检测HBVD-NA,荧光定量PCR检测细胞和上清HBVDNA水平。结果 Southern blot检测提示IFN-α干预后HBV复制水平在R1/H1和R1/H2细胞及R1/H3株中IFN-α抑制细胞内核壳颗粒HBVDNA活性显著高于PS1和PGFP细胞;荧光定量PCR结果提示R1/H3细胞中细胞和上清HBVDNA水平较R1/H1、R1/H2细胞系无显著下降。结论 IFNAR1蛋白表达水平不同可能导致IFN-α抑制HBV复制效应的差异。