AIF的K89琥珀酰化抗体制备及与AIF的互作蛋白研究

目的:本课题组前期发现凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)蛋白在非吸烟女性肺腺癌患者中存在第89位赖氨酸残基琥珀酰化修饰水平增高。本课题组拟制备识别AIF第89位赖氨酸残基琥珀酰化修饰的抗体,用于检测AIF在该位点琥珀酰化修饰。方法:利用在线数据库对AIF蛋白的理化性质、跨膜结构、信号肽、蛋白结构及琥珀酰化位点进行生物信息分析。根据AIF氨基酸序列合成包括89位赖氨酸残基(K89)位点的三条多肽,其中两条含AIF K89的多肽赖氨酸残基进行了琥珀酰化修饰。用三条合成的多肽偶联KLH,然后分别免疫家兔,制备特异识别AIF K89位琥珀酰化修饰的抗体。用ELISA、Dot blot、Western blotting和免疫组化对抗体效价和特异性进行检测。结合胶内酶解和高分辨生物质谱技术分析与AIF相互结合的蛋白。结果:生物信息学分析结果显示,AIF K89琥珀酰化修饰促使AIF 79~99氨基酸残基形成的α-螺旋结构发生变化:由一个较长的α-螺旋变成两个间隔短的较短的α-螺旋。合成的两条琥珀酰化修饰多肽和一条非琥珀酰化的多肽免疫家兔均成功获得相应的抗体;ELISA检测免疫血清抗体效价,分别是1∶486 k、1∶162 k和1∶18 k。制备的识别AIF K89琥珀酰化修饰的抗体识别AIF K89琥珀酰化修饰性多肽的效价是识别非琥珀酰化多肽的效价的27倍;抗体Dot blot检测,该抗体识别AIF K89琥珀酰化修饰性多肽的杂交信号强度是识别非琥珀酰化多肽的效价的20倍;Western bloting结果显示AIF琥珀酰化抗体能特异性识别AIF K89琥珀酰化修饰位点。质谱鉴定与AIF结合的蛋白有XIAP/BIRC4、EIF3G和PRELID1等。结论:生物信息分析提示AIF K89琥珀酰化修饰影响AIF蛋白的结构。制备的AIF K89琥珀酰化抗体能特异性识别AIF K89琥珀酰化修饰,为进一步研究AIF琥珀酰化的机制提供了基础。

CRISPR/Cas9系统构建 ROCK2 基因敲除肺癌细胞系

目的利用CRISPR/Cas9编辑系统对人肺癌细胞系A549、H460细胞中Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2(ROCK2)基因进行稳定敲除,并对其敲除效果进行验证。初步探讨ROCK2基因敲除肺癌细胞株的细胞水平上的功能改变。方法利用Rock-2 CRISPR质粒和Rock-2 HDR质粒转染构建A549、H460 ROCK2基因敲除稳定细胞株。蛋白质印迹法验证敲除效果、用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测ROCK2基因的mRNA表达水平。平板克隆形成实验、MTT法检测各细胞株的增殖能力。结果A549、H460肺癌细胞中ROCK2基因稳定敲除株构建成功。与原始细胞株相比,ROCK2敲除株细胞中的蛋白表达水平完全缺失,细胞内的mRNA表达水平显著下降,而且能降低A549、H460肺癌细胞的增殖能力。结论利用CRISPR/Cas9基因编辑系统获得ROCK2基因敲除的肺癌细胞系,为进一步研究ROCK2对肺癌生长的影响奠定基础。

应用CRISPR/Cas9技术建立敲除AIFM1基因的稳定肺癌细胞株

目的利用CRISPR/Cas9技术在肺癌细胞系A549和NCI-H3255中敲除凋亡诱导因子1(AIFM1)基因,并通过筛选,获得稳定的细胞株。方法利用在线数据库GEPIA、CPTAC、Prognosis和SangerBox分析AIF在肺癌的表达和功能。以AIFM1基因为靶点,设计向导RNA(sgRNA)并利用CRISPR RGEN Tools分析其脱靶效率,CRISPR/Cas9技术敲除肺癌细胞的AIFM1基因和倍比稀释法筛选稳定的单克隆细胞株。采用Western blot检测细胞AIF表达水平。结果TCGA和GTEx数据集结果显示,AIF蛋白在肺癌组织阳性表达率比正常组织高,差异有统计学意义(P<0.05);单因素cox和多因素cox分析发现,pT分期和pN分期是独立危险因素(P<0.05);CPTAC数据库显示,与正常阶段相比,AIF蛋白在肺癌的不同分级分期阶段的表达增加(P<0.05)。AIFM1基因在TCA循环、亨廷顿氏症疾病、氨基酸-核苷酸-糖的代谢和氧化性磷酸化通路中富集显著,差异有统计学意义(|NES|>1,P<0.05);3条sgRNA的序列脱靶效率均为0;与野生型肺癌细胞株相比,用CRISPR/Cas9基因编辑技术修饰的肺癌细胞未检测到表达AIF蛋白,且筛选的杀死A549和NCI-H3255的嘌呤霉素浓度分别为0.60~0.80μg/mL和0.60μg/mL。结论AIF在肺癌中表达上调。利用CRISPR/Cas9技术成功建立AIFM1基因敲除的肺癌细胞株,这将为研究AIF在肺癌发生发展机制提供合适的研究材料。