美洲钩虫蛋白酶抑制剂NaKuI1对蛋白酶的抑制作用的鉴定和特性研究

目的分离美洲钩虫(Necator americanus)Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂1(Na Ku I1)c DNA,并进行原核表达,研究其抑制蛋白酶的效果。方法根据Gen Bank上预测的不完整的Na Ku I基因序列(XM_013449790)设计引物,运用快速扩增c DNA末端技术(SMART-RACE)分别从美洲钩虫成虫c DNA中扩增Na Ku I1 c DNA的5′和3′末端序列,拼接获得全长Na Ku I1 c DNA。将Na Ku I1成熟肽编码基因连接入原核表达载体,构建重组质粒p ET32a-sumo/Na Ku I1,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导Na Ku I1融合蛋白表达。表达产物包涵体经变性、复性、Ni-NTA亲和层析纯化后,用SUMO蛋白酶切割融合蛋白标签后获得重组蛋白r Na Ku I1。用凝血时间法检测r Na Ku I1的抗凝活性,发色底物法检测其对人纤溶酶、胰蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和蛋白酶3、猪胰蛋白酶和胰弹性蛋白酶及牛α-胰糜蛋白酶的抑制作用。结果获得Na Ku I1全长c DNA,其编码的多肽由84个氨基酸残基组成,其中含16个氨基酸残基组成的信号肽,68个氨基酸残基组成的成熟肽。成熟肽原核表达产物为不可溶的包涵体。经变性、复性后纯化的r Na Ku I1无抗凝血活性。在100倍摩尔浓度比下,r Na Ku I1对人纤溶酶(5 nmol/L)、人胰蛋白酶(1 nmol/L)和猪胰蛋白酶(5 nmol/L)活性的抑制率近100%,对牛α-胰糜蛋白酶(1 nmol/L)和人中性粒细胞弹性蛋白酶(5 nmol/L)活性的抑制率分别约31.45%和25.18%,对人组织蛋白酶G、蛋白酶3和猪胰弹性蛋白酶均无抑制作用。r Na Ku I1抑制人胰蛋白酶及纤溶酶的抑制常数(ki)分别为(21.17±7.22)和(21.72±3.95)nmol/L。结论成功分离获得Na Ku I1全长c DNA序列,其原核表达产物r Na Ku I1具有较强抑制胰蛋白酶和纤溶酶活性的特点。

毛首鞭形线虫丝氨酸蛋白酶抑制剂TtSerpin1对蛋白酶的抑制作用

目的原核表达、分离纯化毛首鞭形线虫(Trichuris trichiura)丝氨酸蛋白酶抑制剂1(TtSerpin1),并观察其对蛋白酶的抑制作用。方法从毛首鞭形线虫成虫cDNA中扩增TtSerpin1编码序列(Gen Bank登录号为MF401634),将其连接入原核表达载体,构建重组质粒pET32a-sumo/TtSerpin1。将重组质粒转化入大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导TtSerpin1融合蛋白表达。表达的包涵体蛋白经变性、复性、镍亲和层析纯化、SUMO蛋白酶酶切融合标签后获得rTtSerpin1。用发色底物法检测其对人组织蛋白酶G、中性粒细胞弹性蛋白酶、蛋白酶3、纤溶酶和胰蛋白酶,猪胰蛋白酶、胰弹性蛋白酶及牛α-胰糜蛋白酶的抑制作用。结果成功构建了重组质粒pET32a-sumo/TtSerpin1,并在E.coli中成功表达。表达产物主要为包涵体,复性、纯化后的rTtSerpin1具有较好的蛋白酶抑制活性。1 000 nmol/L的rTtSerpin1对人组织蛋白酶G(100 nmol/L)、中性粒细胞弹性蛋白酶(10 nmol/L)、蛋白酶3(200 nmol/L),猪胰弹性蛋白酶(10 nmol/L),牛α-胰糜蛋白酶(1 nmol/L)的蛋白酶活性抑制率分别为60.89%、82.84%、21.21%、58.32%、96.98%,但对人纤溶酶、胰蛋白酶及猪胰蛋白酶抑制活性较弱。rTtSerpin1对人组织蛋白酶G及中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制常数(K_i)分别为(949.80±91.51)、(242.70±53.41)nmol/L。结论 rTtSerpin1对多种丝氨酸蛋白酶具有较强抑制作用。

美洲钩虫纤溶酶抑制剂NaKuI10的表达与活性鉴定

目的从美洲钩虫(Necator americanus)cDNA中扩增编码NaKuI10基因片段,构建原核表达系统,重组表达并纯化rNaKuI10,采用化学发色法和平板溶解试验等检测其对有关丝氨酸蛋白酶的抑制作用及纤溶活性。方法根据GenBank MH218867序列,从美洲钩虫cDNA中扩增出编码成熟肽NaKuI10基因片段并连接入表达载体,构建原核表达重组质粒pET32a-sumo/NaKuI10,鉴定正确的重组质粒转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,超声破碎细菌后用镍亲和层析纯化表达产物,在纯化柱上用SUMO蛋白酶切割融合标签获得rNaKuI10,用发色底物法检测rNaKuI10对各丝氨酸蛋白酶的抑制活性,通过纤维蛋白平板法和纤维蛋白原降解试验观察rNaKuI10对纤溶酶纤溶活性的抑制作用。结果成功构建了重组质粒pET32a-sumo/NaKuI10,表达产物纯化后获得可溶性rNaKuI10。2倍及等摩尔比的rNaKuI10分别能抑制100%及90.4%的人纤溶酶活性,22.4%及10.3%的人胰蛋白酶活性。但1、2、5倍摩尔比的rNaKuI10对人中性粒细胞弹性蛋白酶,组织蛋白酶G,蛋白酶3,胰糜蛋白酶,胰弹性蛋白酶,凝血酶,凝血因子Xa(FXa)、FXIa、FXIIa、FIXa,活化蛋白C,血浆激肽释放酶及FVIIa/TF均无明显抑制作用。rNaKuI10对人纤溶酶的抑制常数(ki)为(0.83±0.10)nmol/L。2 000nmol/L的rNaKuI10接近完全抑制1 000nmol/L的人纤溶酶对纤维蛋白平板中纤维蛋白的溶解作用,等摩尔比的rNaKuI10可完全抑制人纤溶酶对纤维蛋白原的降解作用。结论 NaKuI10是一种抑制活性强且特异性较好的纤溶酶抑制剂,其生物学功能还需进一步研究。