化妆品功效评价（Ⅻ）——皮肤生理学检测在化妆品功效评价中的应用

阐述了皮肤生理学检测的概念,介绍了皮肤形态组、脂质组、微生物组、功能组等生理学检测方法和指标在化妆品功效评价中的应用,为化妆品进行人体功效评价时皮肤生理学指标的选择提供了参考和指导,并对皮肤生理学检测技术的现状和发展趋势进行了总结和展望。

植物精油化学成分的分析研究

采用GC-MS对红百里香、罗勒、松红梅3种植物精油的成分进行了分析检测。经NIST2011标准质谱数据库检索确认了3种植物精油化学成分,并计算出各组分的含量。

HaCaT表皮模型作为皮肤刺激性体外替代实验的可行性研究

目的采用人永生化上皮角质形成细胞系HaCaT构建表皮模型,探讨其作为皮肤刺激性替代实验的可行性。方法取HaCaT细胞采用气-液面培养的方式构建表皮模型,同法以采用人原代上皮角质形成细胞构建的表皮模型EpiKutis~?作为对照。HE染色观察两种模型的组织形态;采用快速渗透实验方法检测两种模型屏障功能(ET_(50)值);取20种化学标准品分别于两种模型表面受试30 min,孵育42 h后MTT法测定组织相对活力百分比,判断化学品刺激性,并与联合国-化学品分类及标记全球协调制度(UN GHS)体内测试结果分类和经济合作与发展组织(OECD)TG439(2013版)中采用的体外替代方法(validated reference method,VRM)体外测试结果分类进行比较。结果 HE染色示,构建的HaCaT模型无完整复层化结构;屏障功能检测结果示,ET_(50)值为0.99 h;通过20种化学品检测,HaCaT模型的灵敏度为100%,特异性为50%,准确率为75%;EpiKutis~?模型灵敏度为100%,特异性为70%,准确率为85%。结论 HaCaT细胞构建的表皮模型不具备完整的表皮皮肤生理结构特征,屏障功能较低,化学品体外皮肤刺激性测试结果不能完全满足OECD关于刺激物的正确判定标准,不适宜作为化学品皮肤刺激性体外替代检测的工具。

金核/银壳纳米棒在三维表皮模型中的透皮行为和对组织活力的影响

目的:应用三维(3D)组织工程表皮模型(HaCaT,无角质层和Epikutis~?,有角质层)评价金核/银壳纳米棒(gold core/silver shell nanorods,Au@Ag NRs)的透皮行为及对模型组织活力的影响。方法:将Au@AgNRs(80μg·mL^(-1))暴露于表皮模型24 h和72 h。通过电感耦合等离子体-质谱法(ICP-MS)测定进入和穿透表皮模型的金、银元素的量,评价Au@AgNRs在HaCaT和Epikutis~?中的透皮行为。通过将不同浓度Au@AgNRs暴露于表皮模型24 h,用甲基噻唑四唑(methylthiazole tetrazolium,MTT)试验和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放试验测定Au@AgNRs对表皮模型组织活力的影响。结果:Au@AgNRs暴露24 h后,HaCaT和Epikutis~?模型中均检测到金、银元素(HaCaT中金0.980μg、银3.510μg;Epikutis~?角质层中金0.270μg、银0.750μg,细胞层中金0.540μg、银0.570μg);仅HaCaT模型的下层培养基中检测到极少量银元素;Au@AgNRs暴露72 h后,HaCaT和Epikutis~?模型中金、银元素含量较24 h明显增多(HaCaT中金3.650μg、银5.590μg;Epikutis~?角质层中金0.780μg、银1.770μg,细胞层中金1.650μg、银3.490μg);下层培养基中也均检测到少量金、银元素(HaCaT培养基中金0.034μg、银0.053μg;Epikutis~?培养基中金0.004μg、银0.046μg);MTT实验显示,Au@AgNRs可引起HaCaT及Epikutis~?模型组织活力下降(分别为86.34%～20.02%和95.69%～85.43%),并呈剂量-效应关系;在LDH实验中,随着Au@AgNRs浓度的增加,HaCaT模型的LDH释放量从11.31%升高至116.90%,呈剂量-效应关系;Epikutis~?模型LDH释放量无明显变化。结论:无论角质屏障是否健全,Au@AgNRs均可进入甚至透过表皮模型,其透皮行为呈现时间-效应关系;并引起表皮模型剂量依存性组织活力下降。角质层屏障可减轻和减缓Au@AgNRs在表皮模型中的透过率及对皮肤的损伤。

三维表皮模型Epikutis~?参考品的研制

目的:考察体外重组三维(3D)表皮模型(Epikutis^■)作为标准物质及用于替代模型皮肤刺激性检测方法的可行性。方法:利用由人源性角质形成细胞构建的体外重组3D表皮模型(Epikutis^■)作为标准物质的原料,参照经济合作与发展组织439文件(OECD 439):替代模型皮肤刺激性检测方法,选择组织活力和屏障功能指标,考察表皮模型的均匀性和稳定性,并通过多实验协作测定对其组织活力和屏障指数进行分析。其中,组织活力测定采用MTT试验,以阴性对照光密度值作为组织活力指标;屏障功能测定采用1%TritonX-100作用不同时间后,测定半数活性时间,作为屏障指数(ET50)。结果:Epikutis^■表皮模型(每批100多个)的均匀性良好,其样品间均匀性不确定度为:ubb=0.013。短期稳定性(模拟保存运输条件下,运输箱内温度4~25℃放置24 h),组织活力(光密度,OD)为1.029,其短期稳定性不确定度为:us=0.018;ET50的平均值为(2.08±0.12)h,其短期稳定性不确定度us=0.159,无明显活性及屏障功能降低趋势。协作测定结果:OD为1.033。其检测不确定度为:uchar=0.036;最终的合成不确定度(含ubb、us和uchar)为0.043。ET50的协作标定结果为1.70 h;最终的合成不确定度为0.159。选择10种OECD 439提供的参考物质种类,进行皮肤刺激性试验,其结果与OECD439发布的刺激性判定结果一致,符合预期结果。结论:Epikutis^■表皮模型的组织活力:1.033±0.086,最终定值范围为:0.9≤OD≤1.2;ED50(:1.70±0.32)h,最终定值范围为:1.4 h≤ET50≤2.0 h。上述研究结果表明Epikutis^■表皮皮肤模型满足OECD TG 439所推荐的替代模型皮肤刺激性检测方法的使用,可以用于化妆品、化学试剂、医疗器械等皮肤刺激性定性检测,也为纳米材料的透皮吸收及皮肤毒性研究提供了替代方法模型。

基于HaCaT三维表皮模型的纳米银毒性及其毒性机制研究

目的:应用三维(3D)表皮模型(HaCaT模型,无角质层),与二维(2D)HaCaT细胞对比,评价等效浓度下纳米银(AgNPs)对HaCaT模型的毒性效应,并考察其毒性机制。方法:选用同等浓度,即:单位细胞数AgNPs暴露浓度(HaCaT模型组为62.5、125、250、500、1 000μg·mL^-1,对应于HaCaT细胞组为1.75、3.5、7、14、28μg·mL^-1),分别暴露于HaCaT模型及单层HaCaT细胞24 h后,用噻唑盐比色法(MTT)和乳酸脱氢酶释放试验(LDH)测定AgNPs在HaCaT模型和HaCaT细胞中的毒性效应。取同等AgNPs浓度(单位细胞0.7 ng·mL^-1)暴露组,用流式细胞仪检测模型或细胞中活性氧(ROS)含量的变化;用相应试剂盒检测模型或细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性及丙二醛(MDA)的含量;用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测模型或细胞培养液中的炎性因子IL-1α、TNF-α、IL-6和IL-8的含量。结果:随着AgNPs浓度的增加,MTT实验显示HaCaT模型相对组织活力下降至(91.16±3.59)%^(75.66±1.66)%,而HaCaT细胞活性下降至(77.42±5.17)%^(22.43±2.48)%,二者均呈剂量-效应关系;LDH实验显示HaCaT模型的LDH释放量从(0.17±1.12)%升高至(44.9±3.61)%,而HaCaT细胞的LDH释放量从(55.99±1.58)%升高至(68.68±1.42)%,二者均呈剂量-效应关系。AgNPs作用于HaCaT模型和细胞后,均引起SOD和GSH-px合成量下降,ROS的释放量及MDA升高(分别为对照组的3.7倍和11.5倍);抗氧化剂(NAC)能够不同程度地减少以上氧化应激因子的变化;引起IL-1α释放量显著升高(分别为对照组的2.97倍和11.55倍),IL-6和IL-8的释放量降低(分别为对照组的2.09倍和1.36倍、1.4倍和3.83倍)。结论:HaCaT模型较好地模拟了创伤皮肤的形态结构,能够客观地评价创伤皮肤外用敷料的局部作用,是评价纳米材料皮肤毒性风险的候选替代模型。