基于转录组数据的马氏珠母贝EST-SSR位点的信息分析及其多态性检测

为获得稳定可靠的马氏珠母贝SSR分子标记,本文利用MISA软件对转录组测序数据进行了大规模的EST-SSR标记发掘,并分析了位点信息及其多态性。结果表明,马氏珠母贝转录组测序所获得的74007条Unigenes中检测出9872个EST-SSR位点,位点出现频率为13.34%,平均每5102 bp含有1个SSR位点。在转录组SSR中共有132种重复基元类型,其中单核苷酸重复基元为主要类型,占SSR总数的81.46%;单核苷酸重复以A/T基序为主,占SSR总数的71.27%。基于筛选的SSR序列,应用Primer3软件进行引物的批量设计,共为5922条EST-SSR序列成功设计出17766对引物。随机选择80对引物对EST-SSR多态性进行检测,共有62对引物成功扩增出稳定条带,占引物总数的77.5%;其中,17对EST-SSR引物表现出个体多态性,多态性比率为27.42%。以上研究为马氏珠母贝遗传多样性、遗传图谱构建及分子辅助育种研究提供了有效工具,对于马氏珠母贝种质资源保护、优良品种培育和珍珠养殖业的健康发展均具有重要意义。

马氏珠母贝(Pinctada fucata)组织蛋白酶L基因的克隆与表达分析

根据已构建的溶藻弧菌(Vibro alginolyticus)诱导的马氏珠母贝(Pinctada fucata)血淋巴cDNA差减文库得到的ESTs序列,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了其组织蛋白酶L基因(PFCatL),并对其进行了生物信息学分析;应用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术,研究了PFCatL基因在溶藻弧菌刺激前后马氏珠母贝足、外套膜、鳃、闭壳肌等8个组织中的表达变化。结果表明,PFCatL基因cDNA全长2004bp,其中5′非编码区(5′-UTR)50bp,3′非编码区(3′-UTR)865bp,开放阅读框(ORF)1089bp,编码362个氨基酸,其分子量计算值(MW)为40.52kDa,理论等电点(IP)为5.20;生物信息学分析表明,PFCatL含有16个氨基酸残基组成的信号肽序列以及组织蛋白酶前体抑制功能域I29;Clustalw2多重比对发现PFCatL氨基酸序列在催化三联体Cys-His-Asn、底物结合位点以及二硫键形成相关的半胱氨酸残基位点高度保守;Real-time PCR研究发现,PFCatL在马氏珠母贝各组织中均有表达,但各组织间的表达量存在差异,其中以肾和闭壳肌中的表达量最高;溶藻弧菌感染4h后,外套膜、鳃以及血淋巴中PFCatL基因的表达较感染前显著上调。

溶藻弧菌诱导马氏珠母贝血淋巴cDNA差减文库的构建及分析

为了探讨马氏珠母贝免疫防御机制，筛选免疫防御相关功能基因，以致病性溶藻弧菌人工感染的马氏珠母贝血淋巴为材料，采用抑制性差减杂交（SSH）技术，构建了溶藻弧菌诱导的马氏珠母贝血淋巴cDNA差减文库；以马氏珠母贝管家基因β-actin作为差减指标检测该文库的差减效率；对选取的600个阳性克隆进行测序及生物信息学分析。结果显示，该文库的差减效率可达2^10倍；PCR阳性检测显示差减片段为100～750bp，对随机挑取600个克隆的测序结果显示，共获得414个有效EST序列；通过BLAST同源性比对，有167个EST序列（占40．34％）与NCBI数据库中已知功能蛋白质具较高同源性，其中7个EST序列（占1．69％）与免疫防御相关基因同源；此外，204个EST（占49．28％）在数据库中未发现同源序列。研究表明，SSH技术能有效富集马氏珠母贝血淋巴差异表达基因，研究结果为探索马氏珠母贝免疫基因作用机理和调控机制奠定了基础。

马氏珠母贝多聚泛素基因重复单元及3'端非编码区序列的克隆与表达分析

在构建马氏珠母贝(Pinctada fucata)血淋巴抑制性差减文库的基础上,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆马氏珠母贝多聚泛素基因(PfUb)最后一个重复单元及3'端非编码区(UTR)序列。序列长453 bp,其中3′UTR 219 bp;开放阅读框(ORF)234 bp,编码77个氨基酸残基;PfUb重复单元含有7个Lys和1个76Gly泛素基因功能位点。实时荧光定量PCR分析表明,PfUb基因在马氏珠母贝足、外套膜、鳃、闭壳肌、心脏、消化腺、血淋巴7个组织中均有表达,溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)能够诱导马氏珠母贝各组织中PfUb基因的表达上调,其中以鳃和血淋巴中的上调表达最为明显;马氏珠母贝血淋巴中,PfUb基因在溶藻弧菌感染2 h后表达量开始上调,并在感染8 h后达到最大。