壳寡糖和几丁寡糖的制备方法及其在水产上的应用

人们期望无污染、无残留的绿色水产品。但近年来,随着水产养殖密度和规模迅速扩大,水产动物病害频发,滥用抗生素所导致的菌株耐药性等问题逐渐凸显,这给水产养殖可持续发展、绿色发展带来挑战。而壳寡糖和几丁寡糖由于无毒、无害、无残留,具有多种生物活性功能且来源广泛,逐渐被众多学者重视并研究。壳寡糖是几丁质或者壳聚糖经过酶解法、化学法或者物理法而获得的低聚糖,几丁寡糖是几丁质的降解产物或壳寡糖的乙酰化产物。目前,有关壳寡糖和几丁寡糖作为绿色的饲料添加剂、疫苗佐剂和水产品保水保鲜剂的研究已经开展,其在水产养殖中具有非常广阔的发展空间和应用前景。基于此,对壳寡糖和几丁寡糖的制备方法进行了总结,探讨了壳寡糖和几丁寡糖在水产动物饲料添加剂、疫苗佐剂和水产品保水保鲜中的应用,突出其调节水生动物免疫、促生长、抗氧化、影响鱼类体成分等方面的生物活性,以期为壳寡糖和几丁寡糖在水产上的深入研究和产业化应用提供参考。

溶藻弧菌冷冻保护剂配方与冻干工艺研究

【目的】研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)真空冷冻干燥保护剂配方与优化冻干工艺条件,并探究冷冻干燥对菌株毒力及药物敏感性的影响,为菌种在冷冻干燥保藏上的应用提供理论依据。【方法】采用真空冷冻干燥技术,以溶藻弧菌HY9901为研究对象,通过单因素试验及正交试验,探究L-谷氨酸钠、海藻糖、脱脂乳、葡萄糖、甘露醇、甘氨酸6种单一保护剂对菌株活性的影响,筛选最佳冷冻保护剂复配配方,并研究菌液浓度、预冻时间、预冻温度及复水介质4个因素对菌株冻干工艺的影响,优化溶藻弧菌冻干工艺条件。同时,通过储藏试验、半数致死量(LD_(50))试验和药敏试验,探究冻干菌株的活性变化规律及其生物特性。【结果】6种单一保护剂对溶藻弧菌冻干的保护效果存在显著差异,其效果从强到弱依次为:L-谷氨酸钠、海藻糖、脱脂乳、葡萄糖、甘露醇、甘氨酸;菌株最佳冷冻干燥保护剂复配配方为海藻糖50 g/L+L-谷氨酸钠50 g/L+脱脂乳50 g/L,其存活率为62.12%,与单一保护剂的保护效果差异显著;冻干工艺最适条件:菌液浓度1×10~8~10~9 CFU/mL、预冻时间3 h、预冻温度-80℃、复水介质为PBS或50 g/L脱脂乳,此条件下菌株存活率可达到最大值(63.72%)。最佳冻干条件下,菌株储藏60 d期间,其活性无显著差异;菌株冻干前后的LD_(50)分别为1.22×10~8、1.20×10~8 CFU/mL,LD_(50)无显著差异。菌株在冻干前后的药敏抑菌圈直径无显著差异,对氟苯尼考、氯霉素、环丙沙星等药物均表现敏感;对新霉素、卡那霉素均表现中度敏感;对丁胺卡那、哌拉西林等药物均表现耐药。【结论】溶藻弧菌HY9901的冷冻干燥复配配方为海藻糖50 g/L+L-谷氨酸钠50 g/L+脱脂乳50 g/L,冻干工艺条件为菌液浓度1×10~8~10~9 CFU/mL、预冻时间3 h、预冻温度-80℃、复水介质为PBS或50 g/L脱脂乳,该配方及工艺合理可行,具有良好的储藏性及生物稳定性。

红笛鲷免疫器官发育组织学观察

【目的】研究红笛鲷(Lutjanus sanguineus)免疫器官发育,为其健康养殖和疾病预防提供理论基础。【方法】从红笛鲷卵出膜开始取样,至出膜62 d,通过石蜡连续切片,H-E染色,进行红笛鲷3个主要免疫器官胸腺、头肾、脾脏发育的组织学研究。【结果与结论】红笛鲷出膜1 d时出现前肾,3 d肾管之间可见造血干细胞;出膜18 d,胸腺和头肾间出现细胞桥,头肾淋巴化;出膜62 d,肾小球仍存在于头肾中,表明头肾既是淋巴器官也是泌尿器官。红笛鲷出膜8 d时出现脾脏原基和红细胞发育;出膜22 d时观察到淋巴细胞;出膜24 d时淋巴细胞显著变多。胸腺是最后一个出现的器官,红笛鲷出膜12 d时出现胸腺原基;15 d时发现胸腺淋巴化。

草鱼miR-1260对鱼淋巴囊肿病毒中国株复制的调控作用

【目的】鉴定草鱼(Ctenopharyngodon idella)miR-1260(cid-miR-1260),分析cid-miR-1260在鱼淋巴囊肿病毒中国株(Lymphocystis disease virus China,LCDV-cn)感染草鱼卵巢细胞系(Grass carp ovary cells,GCO)过程中的时序表达特性,揭示cid-miR-1260对其靶基因znf574和LCDV-cn复制的调控作用。【方法】制备LCDV-cn感染的GCO细胞,通过茎环RT-PCR和测序鉴定cid-miR-1260;采用定量PCR检测cid-miR-1260在LCDV-cn感染GCO过程中的时序表达;应用生物信息学方法预测cid-miR-1260的靶基因,并用双荧光素酶报告基因系统验证靶基因;通过转染cid-miR-1260 mimic和cid-miR-1260 inhibitor使cid-miR-1260过表达和抑制表达,并用定量PCR检测cid-miR-1260、靶基因znf574、LCDV-cn mcp基因的表达;应用Reed-Muench法测定LCDV-cn在GCO细胞中的滴度。【结果】cid-miR-1260与其他已知miR-1260仅有一个碱基差异,且cid-miR-1260在LCDV-cn感染GCO过程中呈先上升后下降的表达变化,72 h时表达量最高(P<0.05);生物信息学分析表明,znf574为cid-miR-1260的靶基因;重组质粒pmirGLO-znf574-WT与cid-miR-1260 mimic共转染后,荧光素酶活性显著降低(P<0.05),证实znf574为cid-miR-1260的靶基因;cid-miR-1260过表达后,靶基因znf574的表达显著下降(P<0.05),LCDV-cn mcp的表达和LCDV-cn在GCO细胞中的滴度显著上升(P<0.05);抑制cid-miR-1260表达后,靶基因znf574的表达量显著上升(P<0.05),LCDV-cn mcp的表达量和LCDV-cn在GCO细胞中的滴度显著下降(P<0.05)。【结论】LCDV-cn感染GCO细胞后,cid-miR-1260的表达显著上调;在LCDV-cn感染中,cid-miR-1260对其靶基因znf574的表达起负调控作用,且cid-miR-1260表达与LCDV-cn的复制呈正相关,起促LCDV-cn感染作用,而锌指蛋白ZNF574具有抗LCDV-cn作用。本研究为淋巴囊肿病的防治提供新的依据和思路。

凡纳滨对虾ATG13基因克隆及其功能分析

【目的】克隆凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)自噬相关基因13(ATG13),并分析凡纳滨对虾ATG13基因的组织表达特征及其在外源刺激后的表达变化,为探究ATG13基因在凡纳滨对虾抗病原感染过程中的作用机制提供理论依据。【方法】采用PCR扩增凡纳滨对虾ATG13基因,通过ProtParam、Softberry、SMART、InterProScan等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测凡纳滨对虾ATG13基因的组织表达特征及其在哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和Poly(I:C)刺激后的表达变化。【结果】凡纳滨对虾ATG13基因开放阅读框(ORF)为1431 bp,共编码476个氨基酸残基;凡纳滨对虾ATG13蛋白相对分子量为52.4 kD,理论等电点(pI)为5.40,属于疏水性蛋白,不存在信号肽,但其N末端存在1个ATG13功能域(第94~167位氨基酸处)。凡纳滨对虾ATG13氨基酸序列与果蝇(Drosophila melanogaster)ATG13氨基酸序列的相似性高达97%,基于ATG13氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示凡纳滨对虾与果蝇的亲缘关系最近。ATG13基因在凡纳滨对虾肝胰腺、肌肉、鳃、中肠、血细胞、心脏、脑和皮肤等组织中均有不同程度的表达,以肝胰腺中的相对表达量最高,其次是肌肉和中肠,在皮肤和血细胞中的相对表达量较低。经哈维氏弧菌和poly(I:C)刺激后,凡纳滨对虾ATG13基因在肝胰腺、中肠和鳃组织中的相对表达量整体上呈先上升后下降的变化趋势,且在刺激后12、24或48 h达最高值,极显著高于对照组(PBS)(P<0.01)。【结论】受哈维氏弧菌或poly(I:C)等外源刺激后,凡纳滨对虾通过上调自噬相关基因ATG13表达以调控机体清除受损的细胞器和维持细胞稳态,即ATG13基因参与凡纳滨对虾抗病原感染的响应过程。

不同培养温度的鱼源海豚链球菌转录组分析

为鉴定海豚链球菌(Streptococcus iniae)在不同温度的转录水平差异,通过生长曲线测定和人工感染试验分析该菌在25℃和35℃下的生长情况和致病性,采用链特异性转录组测序(Strand-specific RNA-seq)技术对25℃和35℃培养的海豚链球菌Tozj-1菌株进行测序分析,筛选差异表达基因,通过GO(Gene Ontology)数据库和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库对差异表达基因进行GO功能和KEGG通路富集分析,然后利用VFDB(Virulence factor database)数据库筛选差异表达的重要毒力基因并使用实时荧光定量PCR进行验证。结果显示,海豚链球菌在35℃条件下有更快的生长速度和更强的毒力;转录组共筛选获得927个显著差异表达基因(P<0.05),其中包括820个上调基因和107个下调基因;GO功能富集分析发现,差异基因主要富集在代谢、细胞、催化及结合过程;KEGG富集分析发现,差异基因主要富集在核糖体通路、ABC转运通路、群体感应等信号通路。以上结果表明温度调控海豚链球菌基因的转录表达及相关通路的富集,为后续海豚链球菌致病机理的研究提供数据支持。

miRNA-155靶向SOCS5对无乳链球菌诱导罗非鱼脑星形胶质细胞炎症的影响

【目的】探究尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)微小RNA-155(miR-155)和SOCS5(Suppressor of cytokine signaling 5)的靶向关系,并研究其对无乳链球菌诱导的尼罗罗非鱼脑星形胶质细胞炎症反应的影响。【方法】通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测感染无乳链球菌后尼罗罗非鱼脑星形胶质细胞中miR-155、SOCS5及炎症因子表达变化规律,生物信息学方法预测miR-155与SOCS5的靶向关系,双荧光素酶报告基因实验进行靶基因验证,qRT-PCR方法分析过表达和敲降miR-155对SOCS5基因表达的影响和miR-155对SOCS5的调控机制。【结果】无乳链球菌诱导尼罗罗非鱼脑星形胶质细胞中miR-155表达量极显著上升(P<0.001),4 h达到最高值。SOCS5表达量极显著上升(P<0.01),6 h达到最高值。促炎症因子IL-1β、TNF-α表达显著升高(P<0.0001),抑炎症因子IL-10、TGF-β表达显著下调(P<0.05)。构建尼罗罗非鱼SOCS53′UTR野生型和突变型荧光素酶报告载体。双荧光素酶实验结果表明miR-155极显著抑制(P<0.0001)SOCS5野生型质粒表达。突变靶位点后,miR-155对SOCS5的抑制作用极显著降低(P<0.0001),抑制效果减弱53.7%。过表达miR-155能显著抑制(P<0.001)SOCS5表达,而抑制miR-155后SOCS5表达显著上升(P<0.05)。转染miR-155抑制物6 h和12 h后,miR-155表达量显著下调(P<0.01),12 h表达量最低,而SOCS5表达量显著上调(P<0.05),在12 h达到最高值。【结论】miR-155通过靶向负调控SOCS5的表达参与无乳链球菌诱导的尼罗罗非鱼脑星形胶质细胞炎症反应,通过下调SOCS5表达影响炎症变化。

草鱼miR-218鉴定及其对鱼淋巴囊肿病毒中国株感染的调控作用

【目的】鉴定草鱼(Ctenopharyngodon idella)miR-218(cid-miR-218)家族成员,分析cid-miR-218在鱼淋巴囊肿病毒中国株(LCDV-cn)感染草鱼卵巢细胞系(Grass carp ovary cells,GCO)过程中的表达特性,探索cid-miR-218-5p对LCDV-cn感染的调控作用。【方法】从LCDV-cn感染的GCO细胞中,通过茎环RT-PCR获取cid-miR-218家族成员,并进行测序验证和生物信息学分析;用定量PCR分析cid-miR-218家族在LCDV-cn感染GCO过程中的表达;用生物信息学方法预测cid-miR-218家族的靶基因,并利用双荧光素酶报告基因系统验证cid-miR-218-5p的靶基因;通过转染cid-miR-218-5p mimic和cid-miR-218-5p inhibitor上调和下调cid-miR-218-5p的表达,用定量PCR分析cid-miR-218-5p、靶基因il-10和LCDV-cn mcp基因的表达情况;应用GO和KEGG数据库,对cid-miR-218家族可能参与调控的信号通路进行富集分析。【结果】在LCDV-cn感染GCO过程中,鉴定到cid-miR-218-5p、cid-miR-218a、cid-miR-218b、cid-miR-218b-1和cid-miR-218b-2等5个cid-miR-218家族成员,其中cid-miR-218-5p的表达呈先升后降再上升的变化趋势,且差异表达最显著(P<0.05);经生物信息学分析预测,cid-miR-218家族成员有较多共同的潜在靶基因,il-10是共有的靶基因。经验证,pmirGLO-il-10重组质粒与家族成员代表cid-miR-218-5p结合后,其荧光素酶活性降低(P<0.05),证明il-10是cid-miR-218-5p的靶基因。cid-miR-218-5p过表达后,il-10与LCDV-cn mcp表达均显著下降(P<0.05),而抑制cid-miR-218-5p表达后,il-10与LCDV-cn mcp表达则显著上升(P<0.05)。预测表明cid-miR-218家族参与调控病毒感染致瘤相关信号通路。【结论】在LCDV-cn感染GCO过程中,cid-miR-218家族中cid-miR-218-5p起重要调控作用;cid-miR-218-5p负调控其靶基因il-10的表达,并负调控LCDV-cn mcp基因的表达;cid-miR-218-5p和IL-10对鱼淋巴囊肿病诊断和防控有潜在的临床应用价值。

一株黄喉拟水龟致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏分析

[目的]明确广东省深圳市某养殖场黄喉拟水龟的突发性死亡原因。[方法]采用平板划线分离法对患病龟的肝脏、脾脏等病灶组织分离到一株优势菌,命名为GZW01,对分离菌进行形态特征和生理生化特征的鉴定,利用通用引物27F、1492R对16S rDNA序列扩增,采用DNAMAN及MEGA 6.0等软件进行生物信息学分析该病原菌分类地位。动物回归感染试验验证其致病性,药物敏感试验筛选有效的治疗防控方法。[结果]菌株GZW01为杆状革兰氏阴性菌,其氧化酶活性、葡萄糖酸盐试验、甘露醇、甘露糖、蔗糖、阿拉伯糖、肌醇、覃糖、MR、VP、精氨酸脱羧酶等生理生化鉴定为阳性,可使葡萄糖产气;与NCBI上维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)具有99%同源性;回归感染试验表明菌株GZW01对黄喉拟水龟具有强致病性;药敏结果显示,分离菌株对青霉素G、苯唑西林、氨苄西林、四环素、万古霉素、克林霉素6种药物耐受,对克拉霉素药物中度敏感,对庆大霉素、红霉素、氧氟沙星、氨曲南等28种抗生素高度敏感。[结论]引发深圳市某养殖场黄喉拟水龟的突发性死亡的致病菌为维氏气单胞菌。

温度和盐度对珍珠龙胆石斑鱼血清免疫因子活性的联合效应

【目的】研究环境因子温度、盐度同时变化对珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂)血清免疫因子活性的影响,探讨机体抵御温盐变化的生理生化反应规律。【方法】在温度14~36℃、盐度5~45条件下,每个因子各取3个编码水平,设计中心复合实验,构建温度、盐度对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼血清过氧化物歧化酶(SOD)活性、溶菌酶(LZM)活性、补体(C3、C4)含量影响的二次回归模型,分析温度、盐度对上述指标的一次、二次效应,采用响应曲面分析法分析温度、盐度对上述指标的联合效应。【结果】构建的温度与盐度对血清免疫因子影响的二次回归模型方程拟合度高;温度、盐度的一次效应、二次效应对于珍珠龙胆石斑鱼幼鱼血清LZM活性、补体C3含量、补体C4含量的影响极为显著(P<0.01),温度的一次效应对于血清SOD活性的影响极为显著(P<0.01);在实验设定的温度、盐度范围内,温度、盐度对血清LZM活性、补体C4含量存在显著的交互效应(P<0.05)。【结论】温度、盐度可显著影响血清免疫因子的活性,并对LZM活性、补体C4含量存在显著的协同效应,表明温度、盐度是影响珍珠龙胆石斑鱼免疫的重要环境因子。

cid-miR-146a在LCDV-cn感染中的差异表达及其调控作用

【目的】在鱼淋巴囊肿中国病毒株(LCDV-cn)感染草鱼卵巢细胞系(GCO)过程中,分析cid-miR-146a的表达特性,探索cid-miR-146a的调控作用。【方法】采用颈环RT-PCR方法,从LCDV-cn感染的GCO细胞中获得cidmiR-146a;在LCDV-cn感染GCO过程中,用定量PCR方法获取cid-miR-146a的表达变化;用生物信息学方法预测和双荧光素酶系统验证cid-miR-146a的靶基因;转染cid-miR-146a mimic和cid-miR-146a inhibitor对cid-miR-146a进行上调和下调,用定量PCR检测cid-miR-146a、靶基因Flt1和LCDV-cn mcp基因在GCO中的表达。【结果】LCDV-cn感染GCO后3~6 d细胞聚集形成“疤痕”,之后细胞逐渐脱落、裂解,呈现空洞。cid-miR-146a的长度为23 bp,在LCDV-cn感染GCO过程中,cid-miR-146a的表达先上升(72 h前)后下降(72 h后)。用不同生物信息学方法共同预测到cid-miR-146a的靶基因为Flt1,在双荧光素酶系统验证实验中,cid-miR-146a靶向Flt1重组载体后荧光素酶活性降低(P<0.05),证实Flt1为cid-miR-146a的靶基因。对cid-miR-146a进行上调下调后,GCO中cid-miR-146a的表达差异显著(P<0.05)。在cid-miR-146a上调后,靶基因Flt1的表达显著下降(P<0.05),LCDV-cn mcp基因的表达显著上升(P<0.05);在cid-miR-146a下调后,靶基因Flt1的表达显著上升(P<0.05),LCDV-cn mcp基因的表达显著下降(P<0.05)。【结论】在LCDV-cn感染GCO过程中,CPE的变化与cid-miR-146a的表达变化时间点呈正相关。cid-miR-146a负调控其靶基因Flt1的表达,并对LCDV-cn的复制起着正调控作用。生物信息学方法预测说明cid-miR-146a参与调控的信号通路与免疫和肿瘤发生相关。

深圳红树林沉积物可培养细菌多样性及其生物活性筛选

【目的】研究广东深圳红树林沉积物可培养细菌多样性,筛选潜在生物活性菌株及水产病原菌拮抗菌。【方法】采用稀释涂布法分离纯化深圳红树林沉积物中可培养细菌,基于16S rRNA序列分析细菌物种多样性,通过PCR扩增聚酮合酶基因、非核糖体肽合成酶基因检测菌株产次级代谢产物潜力,并采用点种法筛选水产病原菌拮抗菌。【结果】获得177株细菌,隶属于4门20属27种,芽孢杆菌属(Bacillus)是优势菌属,6株细菌为潜在新物种,55株细菌的基因组DNA扩增出至少1种生物合成基因,其中有7株细菌对水产病原菌有拮抗活性。【结论】深圳红树林沉积物可培养细菌资源丰富,有应用于活性次级代谢产物发掘和水产病害绿色防控的巨大潜力。

尼罗罗非鱼干扰素诱导蛋白44基因克隆及表达分析

【目的】探索干扰素诱导蛋白44基因(ifi44)在尼罗罗非鱼各组织的分布特征及其响应无乳链球菌感染和聚肌胞苷酸[Poly(I∶C)]刺激过程中的表达模式,为进一步揭示ifi44基因在鱼类免疫应答中的作用机制打下基础。【方法】克隆On-ifi44基因开放阅读框(ORF),通过ExPASy、TMHMM-2.0、Euk-mPLoc 2.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,根据单细胞转录组测序结果分析On-ifi44基因在细胞层面的分布情况,并采用实时荧光定量PCR检测On-ifi44基因在尼罗罗非鱼各组织中的表达分布特征及在无乳链球菌感染和Poly(I∶C)刺激后的时序表达情况。【结果】On-ifi44基因ORF序列全长1437 bp,编码478个氨基酸残基,其编码蛋白分子量为52.7 kD,理论等电点(pI)为4.97。On-ifi44含有1个TLDc_dom结构域(1~157 aa)和1个GTP-bd结构域(197~322 aa),不含跨膜结构域。On-ifi44氨基酸序列与奥利亚罗非鱼ifi44氨基酸序列的相似性为97.94%;基于ifi44氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示On-ifi44氨基酸序列与奥利亚罗罗非鱼ifi44氨基酸序列聚为一支,二者具有较近的亲缘关系。On-ifi44基因在尼罗罗非鱼的肠道、肝脏、鳃、皮肤、脾脏、体肾、胸腺、脑、头肾、肌肉、心脏等11个组织中均有表达,且主要在T细胞亚群表达;经无乳链球菌感染和Poly(I∶C)刺激后,On-ifi44基因在尼罗罗非鱼脾脏、肾脏、头肾和肠道组织中的相对表达量均发生变化,且存在明显的时间依赖性。【结论】On-ifi44含有1个TLDc_dom结构域和1个GTP-bd结构域,进化保守且在不同物种间具有相似的生物学功能;On-ifi44基因在无乳链球菌感染和Poly(I∶C)刺激后呈时间依赖性上调表达,表明ifi44基因作为重要的调节因子,参与了尼罗罗非鱼抗细菌感染、抗病毒增殖的免疫应答过程。

溶藻弧菌AphB蛋白的原核表达及其乙酰化验证

【目的】研究LysR家族转录因子AphB蛋白是否存在乙酰化修饰,为进一步研究乙酰化修饰对该蛋白功能的影响提供理论基础。【方法】以溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901 LysR家族转录因子AphB为对象,根据GenBank上溶藻弧菌aphB序列(No.WP_005380599.1)设计引物,采用大肠杆菌表达体系异源诱导表达,设置时间、温度和IPTG浓度梯度优化表达条件,最后纯化AphB蛋白,通过抗乙酰赖氨酸特异性抗体验证AphB蛋白的乙酰化修饰程度。【结果】aphB全长约876 bp,37℃时菌液加入0.1 mmol·L^(-1)的IPTG诱导6 h后,AphB蛋白的表达量最高,纯化后的蛋白大小为37.3 kD,AphB自身存在乙酰化修饰位点,但其乙酰化程度在体外不受脱乙酰酶CobB的调控。【结论】初步证明了AphB蛋白是一种乙酰化蛋白且在体外不能被脱乙酰酶CobB脱乙酰化,研究结论丰富了原核生物弧菌中乙酰化修饰的相关理论,为溶藻弧菌毒力基因aphB的翻译后调控机制研究提供了科学参考。

尼罗罗非鱼claudin-5基因克隆及其在无乳链球菌胁迫下的表达分析

【目的】克隆尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)紧密连接蛋白5(claudin-5)基因,分析其在无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)刺激下的表达模式,为进一步了解该基因功能提供依据。【方法】根据NCBI已公布的尼罗罗非鱼基因组预测序列(GenBank登录号:XM_005473513.4),选取其claudin-5基因的CDS区,设计claudin-5基因的克隆及实时荧光定量PCR引物。利用生物信息学对克隆得到的claudin-5进行理化性质和进化分析,采用qRT-PCR分析尼罗罗非鱼claudin-5在各组织中及无乳链球菌刺激下的表达模式。【结果】通过PCR克隆技术获得尼罗罗非鱼claudin-5基因全长序列,共651 bp,编码216个氨基酸;蛋白分子量约23 kD,理论等电点(pI)为8.53;具有4个跨膜结构域和3个蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点。尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼(O.aurea)的claudin-5氨基酸序列相似性高达97.55%;系统发育进化树结果也显示,二者claudin-5氨基酸序列聚为一支,表明二者具有较近的亲缘关系。尼罗罗非鱼claudin-5在脑部的表达量极高,是血细胞等组织的300倍左右,具有明显的组织特异性。经无乳链球菌刺激后,尼罗罗非鱼脑和头肾的claudin-5表达量在12 h时达到最高值,在24 h时有所下调,其中在脑部的表达量于48 h表达量最低,但仍高于0 h,而在头肾的表达量在48~96 h时出现明显上调后下降;肠中claudin-5表达量在无乳链球菌刺激后6~12 h时上升缓慢,在48 h时表达量大幅度上调,并达到最高值,之后在48~96 h时出现下调,但低于0 h;肝脏中claudin-5表达量在无乳链球菌刺激后出现明显下调,在24 h略有回升然后继续下调。【结论】尼罗罗非鱼claudin-5基因在脑组织的表达量极高,具有明显的组织特异性,其编码蛋白在宿主抵抗无乳链球菌入侵的过程中发挥重要作用,尤其是通过血脑屏障抵抗无乳链球菌,保护中枢神经系统。

一株卵形鲳鲹肠道源粪肠球菌的分离鉴定与生物学特性研究

【目的】近年来鱼源益生菌在水产养殖中的应用越来越广泛,然而卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)源的益生菌鲜有报道。从卵形鲳鲹中分离潜在益生菌并对其生物学特性进行分析,为该菌株在卵形鲳鲹中的应用提供理论基础。【方法】无菌采集健康卵形鲳鲹肠道内容物,进行细菌分离与鉴定;对典型菌落做形态观察、革兰染色、生化鉴定、16S rRNA基因序列分析、药敏试验、耐盐能力试验、产酸能力及生长曲线测定和毒力基因鉴定。【结果】根据分离菌株的形态特征、革兰染色、生化特性和16S rRNA基因测序结果比对,分离菌株与粪肠球菌(Enterococcus faecalis)相似度达100%,确定其为粪肠球菌。该菌株菌落呈淡灰白色,为革兰氏阳性球菌,七叶苷、纤维二塘、麦芽糖、甘露醇、水杨苷等生化检测结果均显示阳性。药敏试验结果表明,分离菌株对哌拉西林、多粘菌素B、青霉素、复方新诺明、苯唑西林等药物呈现出不同程度的耐药性;对环丙沙星、麦迪霉素、头孢曲松呈中等敏感,对万古霉素、头孢哌酮、氧氟沙星等11种药物敏感。分离菌株可在0%~8%NaCl浓度下生长,具有一定耐盐性。产酸能力和生长曲线测定结果表明,随着菌株大量繁殖,菌液pH值快速下降,其产酸能力增强。毒力基因鉴定结果表明,分离菌株包含efaA、agg、as、fsrA 4种毒力基因。【结论】该研究成功从卵形鲳鲹肠道内分离到一株潜在益生菌菌株,鉴定为粪肠球菌。该菌株具有良好的耐盐和产酸能力,并含有与肠道黏附相关的毒力基因,可为该菌株的后续应用奠定基础。

大口黑鲈源维氏气单胞菌致病菌的分离鉴定及其毒力和耐药基因分析

【目的】分离大口黑鲈(Micropterus salmoides)患病组织中的致病菌,鉴定致病菌的生理特性,分析其毒力和耐药基因,以期指导临床科学用药。【方法】从广东湛江某养殖鱼厂的患病大口黑鲈病变组织中采集样本,采用稀释涂布法分离细菌,经16S rRNA基因序列比对和生化试验鉴定种属,并进行毒力基因、耐药基因和药敏特性等鉴定。【结果】分离出菌落形态呈圆形、表面光滑呈乳白色、不透明的细菌,编号为MSB-2。经革兰氏染色、生理生化反应等表型鉴定为革兰氏阴性菌中的气单胞菌属(Aeromonas)。通过扩增16S rRNA基因序列并构建系统发育树,进一步鉴定该菌为维氏气单胞菌(A.veronii)。该菌株具有act、aer、aexT等毒力相关基因及tetC、tetA、sull等耐药相关基因。药敏试验结果表明,该菌对羧苄西林、多西环素、头孢氨苄、新霉素、庆大霉素、头孢拉定、米诺环素、头孢唑林等药物敏感。对健康大口黑鲈进行人工回归感染病原菌后,出现与病鱼相似的临床症状,如腹鳍及胸鳍基部充血、肛门红肿、腹部明显膨大等,解剖发现腹腔有大量积液,与自然患病的症状相同。【结论】维氏气单胞菌是引起此次大口黑鲈疾病的致病菌,养殖过程中可选用新霉素、多西环素等批准渔用药物进行防治。

大口黑鲈源豚鼠气单胞菌的分离鉴定及病理性分析

【目的】分析深汕特别合作区某鲈鱼养殖基地大口黑鲈(Micropterus salmoides)突发性死亡原因,探究其病原菌生物学特性,为大口黑鲈养殖中的疾病防控与诊治提供理论参考。【方法】从患病大口黑鲈肝脏、脾、肠等病灶组织中分离得到一株优势菌,命名为SZNH-S20230817;开展形态学特征观察,生理生化特性鉴定,人工感染试验,药物敏感性测试,最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定,16S rRNA序列、耐药基因及毒力基因的鉴定,分析其耐药性和病理。【结果】菌株SZNH-S20230817的序列与豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)AP019195具有99.38%同源性;同时携带aer、act、lip和fl a 4个毒力基因;生化鉴定结果显示,该菌的吲哚、氧化酶、苯丙氨酸、甘露醇、木糖、精氨酸双水解酶和葡萄糖产酸等结果为阳性,确定菌株SZNH-S20230817为豚鼠气单胞菌。回归感染试验发现菌株SZNH-S20230817具有较强致病性,对大口黑鲈的半致死浓度(LC_(50))为1.39×10^(7)CFU/mL。药敏试验结果显示,该菌对头孢唑林、卡那霉素、四环素、万古霉素、氨苄西林和克林霉素等12种抗生素耐药,同时携带qnrS、catI、emrB、Sul1、rmtB等13种耐药基因。组织病理学分析表明,菌株SZNH-S20230817感染可引起鱼体脾脏细胞肿胀、游离、肠黏膜断裂破损、绒毛脱落、肾脏细胞坏死、炎症细胞浸润、肝脏细胞呈空泡化等。体外抑菌试验结果显示大黄和五倍子对该菌的MIC和MBC较低,其余7种中草药对该菌的抑菌能力较弱。【结论】豚鼠气单胞菌是引起本次大口黑鲈突发性死亡的病原菌,其同时携带aer、act、lip和fl a 4个毒力基因,对大口黑鲈的LC_(50)为1.39×10^(7)CFU/mL,对头孢唑林、卡那霉素、四环素等抗生素耐药。低剂量的大黄和五倍子能够有效抑制该菌生长,具备良好的预防和抑制效果。

斜带石斑鱼源致病溶藻弧菌的分离鉴定及病理性分析

【目的】2023年10月,深圳市某养殖基地斜带石斑鱼出现皮肤溃烂、皮下出血及肠炎等症状,明确引发本次斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)突发性死亡的致病菌种类及其生物学特性,以筛选出有效抑制病原菌的消毒剂,为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染斜带石斑鱼的科学防治提供理论指导。【方法】利用平板划线法,从患病濒死斜带石斑鱼的病灶组织中分离病原菌,对病原菌形态特征、生理生化特性、系统进化树、毒力基因和耐药基因及药物敏感性进行研究,并对其进行回归感染试验。【结果】从患病斜带石斑鱼组织中分离得到一株溶藻弧菌,命名为菌株SZGP226;系统进化树分析结果显示,该菌与溶藻弧菌HH101307、IB1、Xmb015聚为一支,序列相似性达99.72%;菌株SZGP226可以分解蔗糖、甘露醇、葡萄糖、尿素,氧化酶活性及V-P等生理生化指标鉴定为阳性;同时携带tlh、toxR、ctsA、sto和vpi 5种毒力基因。药敏结果显示,菌株SZGP226耐受氨苄西林、苯唑西林等9种抗生素耐药,并携带qnrB、fl oR、tetC、tetM、qnrD、gyrA、Sul1、SHV和Oxa-24等9种耐药基因。消毒剂筛选结果显示,氢氧化钠对菌株SZGP226的杀菌效果最好、最小抑菌浓度(MIC)为8 mg/mL。回归感染试验表明,菌株SZGP226对斜带石斑鱼具有强致病性,半致死浓度(LC_(50))为1.63×10^(7)CFU/mL,可引起斜带石斑鱼肝脏、肾脏和脾脏发生明显病理性损伤。【结论】溶藻弧菌是引起本次斜带石斑鱼突发性死亡的病原菌,其致病基因包括tlh、toxR、ctsA、sto和vpi,LC_(50)为1.63×10^(7)CFU/mL。氢氧化钠对菌株SZGP226的杀菌效果最好,在养殖开展前可选择氢氧化钠(3 mg/mL)对养殖环境进行消杀清理。