注射溶藻弧菌疫苗对南美白对虾免疫功能的影响

应用溶藻弧菌疫苗注射南美白对虾,测定了弧菌疫苗对南美白对虾免疫指标的影响以及疫苗的免疫保护作用。结果表明,注射溶藻弧菌疫苗后,血清凝集效价增强,24 h时活力达到最高值,尤其是1.08×108cell/ml组的凝集效价升高最明显,为对照组的6.0倍;在24 h时,3个试验组的凝集效价均明显高于对照组(P<0.05)。溶菌活力注射后6 h即达到最高值,1.08×107、1.08×108cell/ml组的溶菌活力明显高于对照组(P<0.05)。抗菌活力在注射后3 h时最高,明显高于对照组。溶血活力在注射疫苗后有所增强,注射后6 h时1.08×106、1.08×107cell/ml组的活力达到最高,而1.08×108cell/ml组12 h时活力达到峰值。注射疫苗对血清超氧化物歧化酶活力基本没有影响。1.08×106、1.08×107、1.08×108cell/ml对南美白对虾的免疫保护率分别为46.3%、61.0%和75.6%。

温度对溶藻弧菌HY9901株致病性相关蛋白的调控

将溶藻弧菌HY9901株置于15℃、20℃、28℃、37℃四个温度下培养,18h时分别测定细菌含量,胞外蛋白酶(Extracelluar protease,ECPase)表达量以及胞外产物(Extracellular product,ECP)对动物的致死性。结果表明,随着温度升高,菌液浓度、ECPase的活性以及ECP对小鼠和红笛鲷的致死率先升高后下降。28℃培养的细菌浓度、ECPase的活性以及ECP对小鼠和红笛鲷的致死率均为最大。用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析不同温度培养下细菌的ECP和外膜蛋白(Outer membrane protein,OMP),结果显示,不同温度培养的溶藻弧菌ECP和OMP电泳图谱不同。溶藻弧菌主要ECP的分子量为70kD和62kD。ECP 70kD在20℃时的表达量最大,而28℃时ECP62 kD的蛋白浓度最高。45kD OMP随着温度升高,其合成量增大,28℃时达最大值;而40kD和34kD OMP则随着温度的升高而减弱。通过研究电泳纯化的ECP 62kD和ECP 70kD的酶活性和致死试验,证明ECP 62kD具有很强的酶活性和毒性,而ECP 70kD仅具有弱的酶活性和毒性。

尼罗罗非鱼NITR基因的克隆鉴定与组织表达分析

从尼罗罗非鱼脾脏组织中克隆获得新型免疫受体(NITR,Novel immune-type receptor)基因的编码区序列(Gen Bank登录号:KX989509;命名为On-NITR),该基因c DNA全长1 119 bp,ORF为1 026 bp,可编码341个氨基酸,理论分子量为37.38k D,等电点为8.28。通过NCBI BLAST比对发现罗非鱼NITR与其他已报道的物种NITR氨基酸序列相似度为27%-46%。氨基酸序列分析显示:On-NITR具有1个信号肽区域、2个胞外Ig-domain区、1个跨膜结构域,以及1个胞质尾区,该胞质尾区含有NITR典型的免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和一个ITIM类似基序itim,且具有较高的保守性。荧光定量PCR分析显示,On-NITR在健康尼罗罗非鱼组织中均有表达,在肠道、皮肤、肝脏表达水平较高,在胸腺、鳃、脾脏、心脏、脑组织中的表达量较低,在头肾组织中的表达量最低。

溶藻弧菌PEPCK蛋白原核表达及其乙酰化、琥珀酰化修饰的鉴定

构建溶藻弧菌HY9901 PEPCK蛋白的原核表达载体、优化其表达条件,并鉴定该蛋白的乙酰化及琥珀酰化修饰。采用PCR克隆pepck基因,构建pET-28a-pepck并将其转入大肠杆菌BL21(DE3),对重组菌株的培养温度、IPTG浓度及时间进行优化,采用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表达及乙酰化、琥珀酰化修饰。结果显示,pepck基因全长1 629 bp,重组菌株可以正确表达分子质量约60.9 kD的蛋白。诱导温度:在28℃条件下PEPCK存在于上清和包涵体中,在37℃则主要以包涵体形式存在;IPTG浓度:0.2 mmol/L-1.0 mmol/L范围内,PEPCK的表达量无明显差异;时间:在0-8 h内PEPCK表达量随时间增长逐渐增加,诱导8 h后趋于稳定。Western blot显示PEPCK蛋白具有乙酰化修饰和琥珀酰化修饰。成功构建溶藻弧菌PEPCK重组表达菌株,其最优诱导表达条件为0.2 mmol/L IPTG,28℃诱导8 h;经鉴定PEPCK蛋白具有乙酰化修饰和琥珀酰化修饰。