乌鳢出血病的病原及组织病理学研究

对广东顺德勒流镇某水产养殖场患出血病的乌鳢进行病原分离,对分离菌进行形态学分析、生化鉴定、PCR鉴定和人工感染。经鉴定,分离菌为温和气单胞菌,其半致死温度LD50为1.645×105 CFU/g。组织病理学观察表明,鳃小片毛细血管严重充血,基部细胞增生,部分鳃小片相互融合成肉芽肿结构;肝细胞出现空泡,部分区域肝细胞坏死、溶解和脂肪变性;肾小体血管球充血破裂,部分肾小管上皮细胞玻璃样变,细胞质中出现大量空泡;脾脏中血细胞明显增多,淋巴细胞减少;肠黏膜下层和固有膜可见结缔组织增生、水肿现象。温和气单胞菌可引起乌鳢的肝、脾和肾等重要器官出现典型的病理变化并引起死亡。

南美白对虾养成期间病害防治技术的调查

随着南美白对虾(Penaeus vannamei)种质质量下降、养殖水体污染及养殖技术落后等问题的出现,制约了南美白对虾养殖业的发展。笔者调查海南省南美白对虾养成过程中常见病害及其防治技术,记录各种疾病的病原、发病症状及防治技术等,并研讨南美白对虾、水体、病原菌三者之间的影响关系,确定致病机理。调查发现,病害的发生与对虾体质下降和养殖水体的恶化程度有直接与间接关系,而病害防治的基本要求是增强对虾体质,促进养殖环境的物质转换和物质能量流动,提高水体的自净能力和减少有害物质的长期积累,从而减少病害发生,提高养成率和生产收益。

罗湖病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】建立一种快速、灵敏、特异的罗非鱼(Oreochromis spp)罗湖病毒定量检测方法。【方法】根据罗湖病毒节段8保守区设计一对特异性引物,建立检测罗湖病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行了评价。【结果】标准曲线在2.5×10^8~2.5×10^0拷贝数之间有良好的线性关系(相关系数R2=0.999),检测限为2.5×100个拷贝。试验内及试验间变异系数分别为0.11%~0.43%与0.54%~1.13%,重复性强;对水生动物其他病毒和细菌均无扩增反应,有很好的特异性。【结论】新建立的罗湖病毒实时荧光定量PCR检测方法特异性好、灵敏度高、重复性强,可用于TiLV的早期的快速诊断、流行病学调查和防控。

尼罗罗非鱼淋巴毒素α基因克隆与表达分析

【目的】克隆尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)淋巴毒素α基因(lymphotoxin alpha, LTα),分析该基因的组织分布,探讨该基因在抗菌抗病毒免疫过程中的重要作用。【方法】通过RACE技术获得尼罗罗非鱼淋巴毒素α基因(On-LTα)的cDNA全长,通过生物信息学分析其序列结构特征;利用实时荧光定量PCR检测基因的组织分布特征,以及健康尼罗罗非鱼感染无乳链球菌后该基因的表达变化,并进一步分离出尼罗罗非鱼非特异性毒性细胞(NCC),检测脂多糖(LPS)和聚肌胞苷酸(Poly I:C)刺激后,On-LTα在NCC中的表达变化。【结果】On-LTα基因序列全长为2769 bp,包含705 bp开放阅读框(ORF),编码234个氨基酸(GenBank登录号:MK770358)。该蛋白属于跨膜蛋白,具有肿瘤坏死因子(TNF)家族保守结构域。实时荧光定量结果表明,On-LTα在健康尼罗罗非鱼11种组织中均有表达,在脾脏中的表达量最高;无乳链球菌刺激后,该基因在脾脏中的表达量显著升高;LPS与PolyI:C刺激后,On-LTα在NCC中表达量也显著上调。【结论】On-LTα参与了尼罗罗非鱼抗菌抗病毒的免疫应答过程。

尼罗罗非鱼Cullin-1基因克隆及表达

【目的】探究尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)Cullin-1(CUL1)基因在尼罗罗非鱼抵抗病原细菌过程中的作用。【方法】从尼罗罗非鱼脾脏组织中克隆Cullin-1基因(记为On-CUL1),对其进行生物信息学分析,应用实时荧光定量PCR技术分析On-CUL1在健康鱼胸腺、鳃、肝、脾、肠道、头肾、脑、肌肉、皮肤、血液组织,以及经无乳链球菌刺激后病鱼脾、肠道、头肾中的表达。【结果与结论】On-CUL1(GenBank登录号XM003459470.5)编码区为2 331 bp,编码776个氨基酸,理论分子质量为89 ku,理论等电点为8.16。氨基酸序列分析显示,On-CUL1有1个高度保守的泛素样蛋白结构域CUL1 Nedd8(ubiquitin-like domain),N′端有一个的信号肽序列。系统进化树分析表明,On-CUL1序列与伯氏拟丽鱼(Haplochromisburtoni)CUL1相似性最高,为98.7%。q RT-PCR显示CUL1在健康尼罗罗非鱼各组织中均有表达,其中在头肾中表达量最高,其次是胸腺、脑、皮肤,在肠道中表达量最低。经无乳链球菌刺激后,On-CUL1表达量在脾脏和肠道中均显著上调,头肾、脾脏和肠道均在48h表达量最大。CUL1参与尼罗罗非鱼抵抗无乳链球菌过程中的免疫应答。

养殖密度对墨吉明对虾生长、代谢和免疫的影响

在水温(28±1)℃下,将体质量(1.89±0.26)g的墨吉明对虾饲养在1m^(3)的玻璃钢桶中,密度分别为60、90、120、150、180尾/m^(2),每个密度梯度设3个平行,常规饲养管理养殖15d,研究养殖密度对墨吉明对虾的生长、代谢和免疫的影响。试验期间,各组对虾存活率均为100%。试验结果显示,密度为90尾/m^(2)时,墨吉明对虾的质量增加率最高(P<0.05);密度大于90尾/m^(2)时,随着养殖密度的增加,墨吉明对虾的质量增加率随之下降;密度为180尾/m^(2)时,墨吉明对虾的质量增加率达到最低值。当养殖密度为90尾/m^(2)时,墨吉明对虾肝胰腺中谷草转氨酶、谷丙转氨酶和肌肉中琥珀酸脱氢酶的活性最高;当养殖密度为180尾/m^(2)时,墨吉明对虾肝胰腺和肌肉中谷草转氨酶、谷丙转氨酶和琥珀酸脱氢酶均呈下降趋势,而肝胰腺的免疫相关酶酸性磷酸酶和肌肉中的碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶活性异常上升。试验结果表明,不同的养殖密度对墨吉明对虾肝胰腺和肌肉中谷草转氨酶、谷丙转氨酶、琥珀酸脱氢酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性均影响显著(P<0.05)。当养殖密度为90尾/m^(2)时,墨吉明对虾代谢能力与免疫力均处于较高水平,结合养殖综合效益,其适宜的养殖密度应不超过150尾/m^(2)。

红笛鲷SR-BⅠ基因的原核表达及条件优化

根据GenBank上登录的红笛鲷SR-BⅠ基因设计引物,采用RT-PCR方法扩增该基因胞外段序列,然后将该基因胞外段序列定向克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,将重组质粒转入大肠杆菌BL21进行IPTG诱导表达,并对重组表达菌株的表达条件进行优化。结果显示,成功构建了原核表达载体pET28a-SR-BI,并能在大肠杆菌BL21中表达,表达的融合蛋白分子量为50.0ku。融合蛋白的最佳诱导表达温度、IPTG浓度和时间分别为16℃、0.05mmol/L和8h。研究结果为进一步研究SR-BI的功能奠定了基础。

酶解豆粕蛋白替代鱼粉对凡纳滨对虾生长、饲料利用和消化酶的影响

试验旨在研究酶解豆粕蛋白替代部分鱼粉对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生长、饲料利用及消化酶的影响。选用初始体质量为(1.10±0.02)g的健康对虾,随机分成5组,饲养在0.5 m3的玻璃纤维钢桶中,分别投喂酶解豆粕蛋白(0、7.40%、14.80%、22.20%和30.20%)替代基础配方中鱼粉(0、25%、50%、75%和100%)制成5组等氮等脂的饲料,试验时间为56 d。试验结果显示投喂25%和50%的酶解豆粕蛋白替代鱼粉的凡纳滨对虾增重率、特定生长率、饲料系数和蛋白质效率等无差异统计学意义(P>0.05),替代25%组和替代50%组凡纳滨对虾肝胰腺的蛋白酶和淀粉酶活性显著高于对照组(P<0.05)。研究结果表明,凡纳滨对虾饲料中酶解豆粕蛋白替代鱼粉的比例不宜超过50%。

卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)热休克蛋白HSP30基因的克隆与组织表达

[目的]获得卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)HSP30基因并探讨其组织表达。[方法]采用RACE的方法从卵形鲳鲹脾组织克隆HSP30基因的cDNA全序列,并用荧光定量PCR分析在健康鱼及哈维氏弧菌感染后HSP30基因的组织表达。[结果]HSP30基因cDNA序列全长913 bp,包含5′非编码区(5′UTR)89 bp、3′非编码区(3′UTR)188 bp,开放阅读框(ORF)636 bp,编码211个氨基酸。预测其氨基酸序列成熟肽的蛋白分子质量为24.1 kD,理论等电点为5.62。HSP30包括N-末端序列(NTS)、α-晶状体蛋白结构域(ACD)、C-末端序列(CTS)和C-末端延伸(CTE)。系统进化分析结果显示卵形鲳鲹HSP30与高体鰤(Seriola dumerili)HSP30聚为一支。卵形鲳鲹HSP30基因在各组织中均有不同程度的表达,其中肝组织中表达量最高,其次为皮肤、肌肉、脾、心、肾,其他组织的表达量较低。哈维弧菌侵染卵形鲳鲹后,肝、脾和肾组织中HSP30基因mRNA表达量均升高,肝组织中变化最显著。[结论]成功克隆了卵形鲳鲹HSP30基因,为进一步揭示卵形鲳鲹HSP30的抗菌免疫应答机制提供了理论依据。

斜带石斑鱼肠道乳酸菌的分离、鉴定及特性分析

从健康斜带石斑鱼肠道中分离出3株形态特征不同的菌株,经革兰氏染色、氧化酶及触酶反应筛选出3株革兰氏阳性球菌,通过生化鉴定和16S rRNA测序结果发现他们分别为粪肠球菌、乳酸片球菌和乳酸乳球菌,命名为WYZ-1、WYZ-2和WYZ-3。选取嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈氏弧菌以及大肠杆菌以琼脂扩散法测定WYZ-1、WYZ-2和WYZ-3的抑菌活性,结果表明WYZ-3对大肠杆菌无抑制作用,对溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈氏弧菌和嗜水气单胞菌都有较显著的抑制作用,其中对溶藻弧菌和副溶血弧菌抑菌效果最好,抑菌直径为21.5~23.5 mm;粪肠球菌和乳酸片球菌均对5种致病菌有抑制作用,抑菌直径为9.5~22.5 mm。利用药敏纸片琼脂扩散法检测WYZ-1、WYZ-2和WYZ-3对34种常用抗生素的药敏性,结果表明3株乳酸菌均对氨基糖类、喹诺酮类多数、复方新诺明、多粘菌素B和氨曲南表现为耐药,对青霉素类多数、四环素类、大环内脂类及克林霉素和氯霉素敏感;WYZ-3对头孢类抗生素表现为敏感,WYZ-1和WYZ-2则对大部分头孢类抗生素表现为耐药。本研究表明三株乳酸菌均具有广谱抑菌性和对绝大多数抗生素有耐药性。