基于PCR和TOF-MS海洋源产脂肽芽孢杆菌筛选

【目的】准确高效分离红树林等海洋环境中产脂肽芽孢杆菌。【方法】将前期从红树林环境筛出具有抗菌活性的12株芽孢菌株作为研究菌株,采用溶血活性及排油作用对其中的可能产脂肽菌株进行初步筛选,并基于脂肽合成酶基因PCR扩增法对脂肽合成酶基因携带菌复筛,采用飞行时间质谱(TOF-MS)对所产脂肽进行鉴定。【结果】初步发现6株芽孢杆菌具有溶血活性,其中HY-5、HY-4和HN-9这3株具有排油能力,油层透明圈的直径分别为45、32和3 mm。PCR扩增检测到HY-5含有iturin、surfactin和bacillomycin D合成酶基因,HY-4含有iturin、surfactin合成酶基因,HN-9含有iturin合成酶基因。TOF-MS检测到HY-5和HY-4的发酵液含surfactin、iturin和bacillomycin 3种脂肽,HN-9的发酵液只含iturin。【结论】基于PCR与TOF-MS为核心的级联技术,建立一种海洋源脂肽产生菌快速筛选以及脂肽谱快速鉴定的方法,解决海洋源芽孢杆菌在常规培养基难合成脂肽造成的漏筛情况。

基于OSMAC策略的3株海洋真菌发酵条件筛选与优化

【目的】筛选可促进海洋真菌产生代谢产物更丰富的发酵条件,进一步挖掘菌株在抗阿尔茨海默症方面的潜力。【方法】基于OSMAC策略,分别选用马铃薯葡萄糖水(PDB)培养基、察氏培养基、大米培养基和葡萄糖/蛋白胨/酵母膏(GPY)培养基,并设置3种盐度(3、30和100),对Talaromyces sp. 001、Penicillium sp. 019和Aspergillus terreus ZN4-5-4等3株海洋真菌进行小规模发酵培养。通过观察真菌在培养基中的生长状态变化,并根据TLC指纹图谱、乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除和卤虫致死活性筛选模型等技术手段筛选出代谢产物丰富、毒性小且AChE抑制活性与抗氧化活性产物丰富的发酵培养条件。【结果】菌株001的最优发酵条件是盐度3的GPY培养基,菌株019的最优发酵条件是盐度3的PDB培养基,菌株ZN4-5-4的最优发酵条件是盐度3的PDB培养基。【结论】OSMAC策略指导下,改变培养基条件对菌株产生次生代谢产物有显著影响。

鱼干曲霉菌分离株鉴定及产毒特性

【目的】探明湛江市售鱼干中曲霉菌(Aspergillus spp.)分离株产AFB_(1)的特性。【方法】采用马铃薯-葡萄糖琼脂(PDA)对鱼干中的曲霉菌进行分离纯化,根据菌落形态、显微形态观察和ITS序列分析对分离株进行鉴定,采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法分析菌株的AFB_(1)合成量。【结果】鱼干中曲霉菌的分离率高达47.66%,经形态学鉴定发现以黄曲霉(Aspergillus flavus)A03、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)H32、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)M23、欧式曲霉(Aspergillus europaeus)M11、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)B21等为主,其中红笛鲷干(Lutjanus sanguinaus)中黄曲霉菌的含量高达1200 CFU/g。黄曲霉A03在红笛鲷干培养基中常温(27~30℃)培养21 d,产AFB_(1)能力达到3.8 ng/mL。【结论】鱼干中存在产AFB_(1)的黄曲霉菌,警示鱼干中存在AFB_(1)污染的风险。

对虾体内4种真菌毒素超声萃取LC-MS/MS检测及其蓄积分布特征

【目的】建立超声辅助萃取高效液相色谱-串联质谱法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)同步检测对虾各组织及血液中黄曲霉毒素(AflatoxinB1,AFB1)、T-2毒素(T-2)、赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)与脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)。【方法】取对虾肌肉、头胸部、虾壳、肝胰腺、肠道和血液样品,采用乙腈/水(体积比85∶15)为提取溶剂,20℃超声辅助萃取60 min,正己烷脱脂,以MycoSpinTM 400柱净化,采用液相色谱-串联质谱法进行检测,用Hypersil Gold-C18色谱柱分离;以流动相甲醇和5 mmol/L的乙酸铵(含0.1%甲酸)进行梯度洗脱,流速为0.25 mL/min;采用正负离子扫描模式,外标法定量。【结果】4种真菌毒素在各自线性范围内线性良好,相关系数(r^2)均大于0.99,定量限为0.3~3.0μg/kg,回收率为75.0%~105.4%,相对标准偏差(Relative standard deviation,RSD)为2.1%~14.5%,通过超声辅助萃取条件优化,显著提高了对虾组织中真菌毒素的提取率。【结论】LC-MS/MS方法前处理简单、检测速度快、净化效果好、结果准确、可靠,适合对虾各组织中多种真菌毒素的快速检测。真菌毒素在对虾不同组织中的蓄积特征,AFB1、T-2、OTA和DON均主要蓄积于对虾肠道与血液中,蓄积率分别达到43%~52%和31%~45%,头部、肌肉、肝胰腺和外壳蓄积率均低于10%,并非真菌毒素残留的靶向组织。