2008年-2009年广东番鸭细小病毒分子流行病学研究

VP2基因是番鸭细小病毒(MDPV)的主要免疫原性基因,其编码的VP2蛋白能够诱导机体产生中和抗体。本文对2008年～2009年从广东各县市分离、鉴定的11个MDPV野毒株VP2基因进行克隆测序,并对获得的VP2基因序列进行比较和分析。结果表明:11个不同分离株之间核苷酸序列同源性为98.7%-100%;与6个国内外参考毒株同源性为97.7%-99.6%;所有毒株都含有4个完全相同的潜在糖基化位点;说明该病毒保守度高,仅有个别的点突变。将分离株SL2连续传70代获得致弱毒株SL-70,动物实验结果表明SL70株对雏鸭无致病力;经测序发现SL-70与其祖代分离株SL2的VP2基因序列同源性高达99.9%,仅发生了18个碱基的点突变。

2010年-2011年广东地区PRRSV Nsp2和ORF5基因的遗传变异分析

为了解2010年-2011年广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况,采用RT-PCR方法扩增所分离的16株PRRSV的Nsp2和ORF5的基因,应用DNA Star、ClustalX2和MEGA5等对所得序列进行比对及遗传变异分析。16株PRRSV的Nsp2和ORF5基因的推导氨基酸序列同源性分别为75.3%～100%和87.5%～100%,与国内高致病性PRRSV代表毒株JXA1的氨基酸同源性分别为74.2%～98.2%和87.5%～99%。Nsp2遗传进化分析显示,这16株PRRSV均属于美洲型毒株,其中15株病毒与以JXA1为代表的国内流行毒株处于同一分支,属美洲亚群Ⅰ;另外1株病毒与VR-2332和疫苗株MLV处在同一分支,属美洲亚群Ⅱ。2010年-2011年广东地区流行毒株仍为高致病性PRRSV,且存在经典疫苗毒株MLV。

探索中国特色现代农业产业化发展的新路——广东温氏食品集团跨越式发展的启示

座落于广东省云浮市新兴县的广东温氏食品集团有限公司（下简称温氏集团），成立于1983年，是一家以养鸡业、养猪业、奶牛业为主导，兼营食品加工、生物制药、粮食贸易的跨行业、跨地区发展的大型畜牧企业集团。温氏集团实行“公司＋基地＋农户”、“产、供、销”一条龙以及“科、

鸽毛滴虫感染Dot-ELISA检测方法的建立

为了制备兔抗鸽IgG抗体-HRP,建立斑点酶联免疫吸附试验定性检测鸽毛滴虫抗原的检测方法,将纯化的鸽IgG加入佐剂免疫兔子,获取纯化的兔抗鸽IgG抗体;采用简易过碘酸钠法标记兔抗鸽IgG,获取兔抗鸽IgG抗体-HRP;同时将鸽毛滴虫用超声波粉碎加入佐剂后多次免疫健康鸽获取鸽抗鸽毛滴虫高免血清(一抗);然后在2×106个/mL的鸽毛滴虫抗原量下,用不同浓度的一抗抗体、兔抗鸽IgG抗体-HRP进行试验;并对70个临床样品进行检测。结果显示,在2×106个/mL的鸽毛滴虫抗原量下,一抗与兔抗鸽IgG-HRP最佳工作浓度分别为1∶100和1∶500;70个样品中,48个镜检为阳性的样品用Dot-ELISA检测有44个呈阳性,阳性符合率为91.7%;22个镜检为阴性的样品用Dot-ELISA检测有12个呈阴性,阴性符合率为54.5%;Dot-ELISA检测与镜检结果的总符合率为80%。结果表明,本试验成功地建立了鸽毛滴虫感染的Dot-ELISA检测方法。

黑曲霉木聚糖酶基因xynA的克隆及真核表达载体的构建

从黑曲霉(Aspergillus niger)GI M3.452中克隆得到木聚糖酶基因xynA的成熟肽编码序列。通过重叠延伸PCR将不带原基因信号肽编码序列的xynA基因片段和猪腮腺分泌蛋白(parotid secretory protein,PSP)基因的信号肽进行拼接得到融合片段SPA,并将其克隆到真核表达载体pcDNA6/HisTMA中,得到重组质粒pcDNA-SPA,重组质粒经过酶切、测序鉴定其读码框的正确性,在脂质体介导下将重组质粒pcDNA-SPA转染猪肾细胞(PK15),通过RT-PCR证实其在PK15细胞中表达,并在细胞培养液中检测到木聚糖酶活性为7.6I U/mL。

细胞因子在疫苗中的免疫增强作用

细胞因子是免疫活性细胞和其它细胞分泌的具有多种生物活性的多肽或蛋白质,这些细胞因子是重要的信息传递物质,特别在免疫、炎症和造血系统等生物学反应过程中具有重要的作用。细胞因子用于重组疫苗上的研究已成为生物学研究中最活跃的领域之一。在基因工程疫苗研制中,常把细胞因子基因(如IL-2、IL-1等)和保护抗原基因连接在一起,构成融合蛋白,以增强疫苗的抗体产生和细胞免疫水平。以干扰素和白细胞介素为例,叙述了细胞因子在免疫增强剂和免疫治疗剂、构建新型基因工程苗等方面的主要研究进展。

应用PCR快速诊断番鸭细小病毒病和小鹅瘟

根据GenBank中已发表的番鸭细小病毒(MDPV)和鹅细小病毒(GPV)全序列,分别设计并合成特异性引物MDPVF/R和GPVF/R,对细小病毒属成员GPV、MDPV、犬细小病毒(CPV)及鸭常见病毒病病原如鸭瘟病毒(DPV)、鸭病毒性肝炎病毒(DHV)、鸭呼肠病毒(DRV)、流感病毒(AIV)的核酸进行PCR扩增。结果表明,引物特异性良好,引物MDPVF/R只能特异性扩增出MDPV的714 bp基因片段,引物GPVF/R只能特异性扩增出GPV的570 bp基因片段;敏感性试验结果表明,MDPV DNA最低检出量为17.5 pg,GPV DNA最低检出量为13.7 pg。该方法的建立对这两种疾病的鉴别诊断具有重要意义。

新型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中已发表的1型鸭病毒性肝炎(duck hepatitis virus type1,DHV-1)和新型鸭病毒性肝炎(new type duck hepatitis virus,N-DHV)全基因序列,在非同源区域设计一对新型鸭病毒性肝炎特异性引物P1/P2,对鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鹅细小病毒细胞毒、流感病毒等鸭常见病病原进行RT-PCR扩增。结果表明引物特异性良好,引物P1/P2仅能特异性扩增出N-DHV的638bp基因片段;敏感性试验结果表明:N-DHV RNA最低检出量为21pg。同时对临床样品的检测中发现DHV-1和N-DHV存在混合感染的情况。该方法的建立为鸭病毒性肝炎病毒尤其是新型鸭病毒性肝炎病毒的鉴定及快速诊断提供了可靠的依据。

原位杂交检测鸡肿瘤病

本研究旨在运用原位杂交检测方法检测鸡的肿瘤病。根据GenBank中登录的MDV、ALV-J和REV参考毒株序列,设计并合成3对引物,经PCR方法扩增出相应的片段,并进行了克隆测序。将测序正确的片段亚克隆至pSPT-18,经转录得到DIG标记的特异cRNA探针。将探针分别与3种肿瘤病阳性组织石蜡切片进行杂交,可看到阳性信号,特异性、敏感性较好。运用该方法对32份疑似肿瘤病料进行了检测,MDV、ALV-J和REV的阳性率分别为25.00%、18.75%和3.13%。结果提示,鸡肿瘤病在鸡场中仍广泛存在。

番鸭源鹅细小病毒ZQ株VP2基因的克隆和序列分析

根据国内外已发表的鹅细小病毒（GPV）B株和GD株基因序列，应用DNA Star分子生物学软件设计一对引物，应用PCR技术扩增GPVZq株的结构蛋白基因VP2全基因片段。将扩增得到的VP2全基因克隆到pMD18-T载体上，获得的重组质粒经PCR鉴定后进行序列测定。结果表明ZQ株基因大小为1764bp，编码587个氨基酸，其基因序列与GPV参考毒株推导的氨基酸序列同源性在89．1％～99．3％之间，差异较大；与番鸭细小病毒（MDPV）参考毒株相比同源性在92．0％～92．5％之间，超过与部分GPV毒株的同源性，推测可能与该毒株来源于番鸭而不是鹅有关，另外也在基因水平上解释了GPV与MDPV在血清学上存在交叉反应的部分原因。

用于检测孔雀石绿的全抗原的合成与鉴定

采用重氮化法,将半抗原副品红(Pararosaniline,PA)分别与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,反应得到免疫抗原和包被抗原,其偶联最佳结合比分别为8.8∶1,12.7∶1,6.9∶1,经紫外扫描光谱和蛋白电泳鉴定得到全抗原。用制备的抗原乳化后免疫小鼠获得了效价较高的多克隆抗体。为进一步制备抗孔雀石绿单克隆抗体打下基础。

樱桃谷鸭白介素18基因的克隆与原核表达

从鸡新城疫病毒刺激的鸭脾脏淋巴细胞培养液中提取基因组RNA,采用RT-PCR方法扩增鸭IL-18基因,插入pMD18-T载体,进行序列测定与分析。将成熟鸭IL-18基因亚克隆到表达载体PBCX中,并转化入大肠杆菌E.coliBL21进行表达。测序结果表明,该基因由603个核苷酸组成,包含一个完整阅读框,共编码201个氨基酸。表达载体经IPTG诱导表达出相对分子量约为59KD的融合蛋白。

猪流感(H1N1+H3N2)油乳剂灭活疫苗免疫后备母猪的抗体动态

本研究对同1条生产线的1683头后备母猪接种猪流感二价灭活疫苗,免疫后对试验组和非免疫组定期进行抽样采血,检测HI抗体水平,计算各组猪群的平均抗体水平。结果表明,第1次免疫后1个月H1NI抗体水平为9.05log2,H3N2抗体水平为6.50log2;在2免后2个月H1NI抗体水平达到高峰为10.15log2,而在2免后3个月H3N2抗体水平达到高峰为10.05log2;然后抗体水平逐步下降,免疫组H1抗体水平大于8log2,H3抗体水平大于6log2的时间可维持6个月以上。

肉鸡盲肠球虫病与坏死性肠炎混感的诊治

鸡球虫病足由艾美耳科的多种球虫引起的一种常见的急性原虫病，其中毒害艾美耳球虫可引起肓肠球虫病。鸡坏死性肠炎是由A型或C型魏氏梭菌在鸡肠道内生长繁殖并产生毒素而引起的以肠粘膜坏死脱落、排带衄的黑色粪便为特征的一种急性传染病。两病经常混合感染，导致肉鸡生长发育迟缓并出现部分鸡只死亡，使料肉比升高、饲料报酬率下降，对养鸡业尤其是肉鸡生产危害极大。此类病例多发于炎热、潮湿多雨的季节。2009年2月，正值华南地区多雨的季节，天气时而闷热，禽场潮湿，细菌容易大量增殖，肉鸡群中球虫病和坏死性肠炎合并感染的情况时有发生。

番鸭传染性脱毛症的流行病学调查及防治

番鸭传染性脱毛症是近来在广东云浮番鸭养殖户出现频率较多的疾病之一，针对这个问题我们进行了长期的调查及跟踪并得到了一些结论，汇报如下，供广大养鸭户参考。

番鸭细小病毒XX株VP2基因的克隆和序列分析

根据国内外已发表的番鸭细小病毒(MDPV)FM株和GD株基因序列,应用DNAstar分子生物学软件设计1对引物,应用PCR技术扩增MDPV XX株的结构蛋白基因VP2全基因片段。将扩增得到的VP2全基因克隆到PGEM-T easy载体上,经菌液PCR鉴定后的重组子进行序列测定。结果表明,MDPV XX株基因大小为1764bp,编码587个氨基酸,其基因序列与国内外发表的FM株、GD株核苷酸序列同源性分别为98.4%和99.8%,而与同属的小鹅瘟病毒B株核苷酸同源性仅为78.2%。可见编码番鸭细小病毒结构蛋白的VP2基因较保守,且和同属的小鹅瘟病毒明显不同,这也是该病毒目前只有一个血清型的分子基础。

番鸭小鹅瘟病毒云浮株的分离与鉴定

2008年初，广东云浮思劳片区番鸭养殖场出现下痢、张口呼吸、脚软、堆积、采食量减少等症状。发病后的前3天曾经用过抗生素治疗，但没有效果，死亡率高达80％。病理解剖主要表现为肠道中后段膨大约3倍、整个肠道出血严重，有凝固性栓子。肝脏肿大，胆囊明显膨大，肾脏肿胀。为查明原因，笔者对发病的雏鸭进行病毒的分离与鉴定工作，通过病毒分离、PCR、琼脂扩散和动物回归试验证实获得1株番鸭小鹅瘟病毒。经番鸭胚接种、雏番鸭攻毒试验，证实所分离的病毒具有较强的致病性。

鸡关节型滑液囊支原体感染的诊断

2008年10月，广东某大型养殖公司一鸡场发生一种以5—7周龄鸡站立困难，行走不稳，腿关节肿大，特别是在滑液囊末端有水泡样肿块为特征的传染病。该病病程长，病鸡精神差，羽毛粗乱，消瘦，喜卧，死亡率低，根据临床症状、病理剖检和实验室诊断确诊为鸡的滑液囊支原体感染。现将情况报道如下。