广东省部分规模化猪场乙脑抗体的监测与分析

采用ELISA的方法,于2008年7月到2009年6月期间,对广东省16个规模化猪场进行了为期1年的乙脑血清抗体的系统监测。结果显示,免疫过的种猪的血清阳性率为92.4%,而未免疫的商品猪也达到了54.5%。表明在广东省的规模化猪场中普遍存在乙脑流行,加强乙型脑炎的防控工作,避免人猪间乙脑的相互传播具有重要意义。

罗非鱼无乳链球菌生物学特性与致病力研究

本试验分离纯化1株致使罗非鱼具有链球菌发病症状的病原菌,药敏试验结果表明,该菌对氯霉素等10种药物敏感。PCR扩增该菌的cfb基因,将扩增片段测序后与GenBank上登录的罗非鱼无乳链球菌的cfb基因序列进行比对。同时对该病原菌的生物学特性进行研究,包括培养时间和pH对该菌生长的影响;培养温度对其致病力的影响;探讨了不同攻毒方式(腹腔、胸腔和背部肌肉注射)与鱼发病快慢的关系;并对不同规格(100和10g左右)的罗非鱼对该菌的易感性进行分析。试验结果表明,该病原菌为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae);该菌的最适培养时间为11.5h,最适培养pH为7.5;腹腔、胸腔和背部肌肉注射后,其发病时间几乎一致,但胸腔注射的试验鱼死亡速度最慢,背部肌肉注射是较安全可行的攻毒方式;33℃培养的无乳链球菌攻毒的罗非鱼发病最快,死亡最集中;100g的试验鱼比10g的试验鱼更易感染。

广东猪输血传播病毒流行病学调查及其主要抗原编码区进化分析

为了解广东省猪群中猪输血传播病毒(TTSuVs)的感染情况,采用Nest-PCR方法对广东省7个不同地区规模化猪场抽检采集的159份育肥猪血清进行检测。结果表明,TTSuVs的2个种——TTSuV1和TTSuV2的阳性检出率分别为54.72%和35.22%,二者的共感染率为29.56%,说明TTSuVs在广东猪群中有较为广泛的传播。挑选Nest-PCR检测TTSuV1和TTSuV2为阳性的样品,分别在病毒保守区设计引物,扩增病毒基因,测序验证后,与其它已发表的不同属种TTVs ORF1序列进行进化树分析。结果表明猪TTVs与人、犬、猫、猴的TTVs分别处在进化树的不同分枝,具有很大差异;本次研究获得的TTSuV1ORF1序列与国内多株已发表的TTSuV1ORF1序列相似性为72%～75%;获得的TTSuV2ORF1序列与现有测序的多株TTSuV2的ORF1序列相似性为88%～97%。此研究为进一步研究TTSuVs流行状况、血清学诊断方法和临床防治技术奠定基础。

虎斑乌贼幼体对盐度及pH值耐受力的研究

采集南海水域虎斑乌贼(Sepia pharaonis)受精卵,在室内条件下进行人工孵化。孵化水温23～25℃,盐度29.0‰。研究了虎斑乌贼幼体对不同盐度、pH值的耐受力影响。结果显示,虎斑乌贼的生存适宜盐度为20‰～35‰,25‰组具有最高的饥饿存活系数。虎斑乌贼幼体对pH值的适宜范围有两个,一个是接近中性,另一个是8.4～9.0,且pH=8.4时乌贼幼体有最高的饥饿存活系数。

副猪嗜血杆菌OMP5基因的克隆、表达及间接ELISA检测方法的建立

【目的】利用表达纯化的副猪嗜血杆菌(Haemophilus Parasuis,HPS)外膜蛋白P5(outer-membrane protein P5,OMP5),建立检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测方法。【方法】克隆扩增HPS OMP5基因,并将OMP5基因与原核表达载体pET-32a(+)连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入受体菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。亲和层析法纯化蛋白,尿素梯度透析复性,Western blot鉴定表达产物。将超声破碎抗原和复性蛋白分别按不同浓度包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其它条件进行优化,最终建立检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法。【结果】利用克隆表达的HPS OMP5蛋白做抗原,通过方阵滴定法确定蛋白最佳包被浓度为1:400,血清的最佳稀释度为1:160。用建立的间接ELISA方法检测317份未进行HPS免疫的健康猪血清,结果检出72份阳性,检出率为22.71%,与广东地区发病猪中的HPS分离率24%接近。同时,用该方法与用超声破碎抗原建立的ELISA方法同时检测了78份血清样品,结果,该法检出27份阳性,检出率为34.62%,后者则检出31份阳性,检出率为39.74%,二者符合率为71.79%。【结论】本研究利用重组表达的OMP5蛋白作为抗原建立的检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法,特异性好、重复性好,检出率与HPS临床分离率接近,可用于副猪嗜血杆菌的临床检测、流行病学调查和免疫监控。

肉鸭中黄病毒的分离与鉴定

为探索2011年年底在广东阳江地区某肉鸭场出现的病鸭和死鸭的发病原因,对其中2个发病鸭场的病死鸭进行了解剖,对病变组织的样品应用RT-PCR的方法进行了病原鉴定。经剖检,发现鸭心脏表面形成小结节,伴有少量心包积液;肝脏和胆囊肿大;脾脏有花斑;胰腺和直肠有出血点。利用病料研磨上清和病料接种后的鸡胚尿囊液进行RT-PCR检测,结果显示鸭黄病毒阳性。序列分析显示,该病毒的核苷酸序列与坦布苏病毒Fengxian株的相似性为99%。试验结果表明,该病毒为黄病毒,是引起此次鸭场发病的病原。

IL-12联合雷帕霉素增强PRRS弱毒疫苗诱导的细胞免疫

将白介素-12(Interleukin-12,IL-12)联合雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)作为免疫佐剂,与猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)弱毒疫苗联合免疫小鼠后,评价其诱导产生的细胞免疫水平,探讨将IL-12和雷帕霉素作为PRRS弱毒疫苗免疫佐剂的可行性。首先将PRRS弱毒疫苗免疫小鼠,然后连续3 d注射(包括免疫当天)IL-12和不同剂量的雷帕霉素,通过ELISA试剂盒检测小鼠血清中IFN-γ的含量,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖,通过流式细胞仪检测记忆性CD8+T细胞比例的变化。结果显示,将IL-12联合低剂量雷帕霉素作为PRRS弱毒疫苗免疫佐剂可明显促进小鼠脾淋巴细胞的增殖,IFN-γ的分泌,,提高记忆性CD8+T细胞的数量。说明IL-12联合低剂量雷帕霉素可增强PRRS弱毒疫苗诱导的细胞免疫应答,具有作为免疫佐剂的可行性。

软颗粒饲料和冰鲜鱼在深水网箱养殖军曹鱼中投喂效果比较

为比较研究深水网箱养殖军曹鱼中分别投喂软颗粒饲料和冰鲜鱼的养殖效果,选取平均体重93 g的军曹鱼幼鱼在深水网箱内进行了为期10周的养殖试验。试验组投喂软颗粒饲料,对照组投喂冰鲜小杂鱼。结果显示:粗蛋白与粗脂肪含量分别为46.3%和7.6%的软颗粒饲料(干物质)能基本满足军曹鱼的营养需求;与对照组相比,试验组的军曹鱼增重率和特定生长率略低,存活率高9.0%,饲料系数低61.2%,养殖成本高3.85%。研究结果表明,投喂软颗粒饲料的养殖效果与冰鲜鱼相近,存活率更高,更具环保效益。

副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5对豚鼠树突状细胞成熟及功能影响

为研究副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)外膜蛋白P5对豚鼠骨髓来源的树突状细胞(Dendriticcell,DC)刺激淋巴细胞增殖功能及细胞因子分泌的影响,以GM-CSF、IL-4联合诱导骨髓细胞生成未成熟DC,加入不同剂量副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5,观察DC形态,检测混合淋巴细胞反应,ELISA法测IL-6、IL-12p70、TNF-α分泌情况。结果显示:经副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5刺激后,可获得具有典型树突状突起形态的DC;经5μg.mL-1P5刺激的DC较对照IL-6、TNF-α分泌量极显著增加(P<0.01),IL-12的分泌量有所增加(P>0.05);50μg.mL-1P5刺激的DC较对照IL-6分泌量极显著增加(P<0.01),IL-12p70和TNF-α分泌量均极显著下降(P<0.01)。诱导后的DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力极显著增强(P<0.01)。本研究证明P5能影响骨髓细胞来源的DC的分化、成熟及功能的发挥,且不同剂量的P5对DC的成熟程度影响有差异。

溶菌酶对断奶仔猪生长性能和血液生化指标的影响

试验以(28±2)日龄长白×大白二元杂种断奶仔猪为研究对象,通过在饲料中添加溶菌酶,研究其对断奶仔猪生长性能、腹泻以及血液生化指标的影响。试验结果表明,在1～15 d,溶菌酶高剂量组比空白对照组平均日增重提高46 g,比抗生素组高22 g,但差异不显著(P>0.05);溶菌酶低剂量组、溶菌酶高剂量组和溶菌酶+抗生素组与空白对照组相比腹泻率分别降低61.33%、56.75%和59.04%,且差异显著(P<0.05)。在1～30 d,溶菌酶高剂量组比空白对照组日增重提高13 g,差异不显著(P>0.05);溶菌酶低剂量组、溶菌酶高剂量组和溶菌酶+抗生素组、抗生素组与空白对照组相比腹泻率分别降低77.56%、74.91%、76.33%和55.21%,且差异显著(P<0.05)。溶菌酶高剂量组的白细胞数量比溶菌酶低剂量组、溶菌酶+抗生素组和抗生素组有明显降低,且差异显著(P<0.05)。血小板数溶菌酶低剂量组和空白对照组明显高于抗生素组,且差异显著(P<0.05)。试验各组的血红蛋白浓度差异不显著(P>0.05)。溶菌酶高剂量组的炎症指数明显低于溶菌酶低剂量组和抗生素组,且差异显著(P<0.05),也低于溶菌酶+抗生素组和空白对照组,但差异不显著(P>0.05)。免疫强度指数溶菌酶高剂量组明显低于溶菌酶低剂量组、溶菌酶+抗生素组和抗生素组,且差异显著(P<0.05),也低于空白对照组,但差异不显著(P>0.05)。

溶菌酶在养殖中的应用

溶菌酶（Lysozyme，EC3.2.1.17）存在于哺乳动物的泪液、唾液、血浆、乳汁、胎盘、体液及组织细胞内，其中以蛋清中含量最丰富。溶菌酶对革兰氏阳性菌有抑制作用，而对没有细胞壁的动物体细胞不会产生影响，因此安全性很高。溶菌酶作为抗生素的替代品，被WHO和许多国家认定为无毒、无害、无残留及安全性很高的天然蛋白质，目前已经被广泛应用于医药、食品和畜牧业等领域，2010年溶菌酶被我国卫生部批准为食品添加剂。

溶菌酶在饲料中的应用

溶菌酶（Lysozyme）又称胞壁质酶或N-乙酰胞质聚糖水解酶,是动物体内一种非特异性免疫因子,具有抗菌消炎、抗病毒、增强免疫力、促进双歧杆菌等有益菌增殖的作用.本文介绍了溶菌酶的特性、分类,重点综述了溶菌酶作为饲料添加剂在猪、鸡、鸭以及反刍动物等饲料中的应用. 1 溶菌酶的特性 溶菌酶,又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶,能水解肽聚糖中的N-乙酰葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4糖苷键,以此破坏细菌的细胞壁,具有较强的抑菌抗菌活性.溶菌酶是一种白色、微白色结晶型或无定型粉末,无臭、味甜且易溶于水,不溶于丙酮和乙醚等有机溶剂,在干燥室温可长期保存.化学性质非常稳定,对热也极为稳定.当pH在1.2～11.3范围内剧烈变化时,其结构几乎不变.在酸性环境中,溶菌酶对热的稳定性很强,在pH4～7范围内,100℃处理1分钟仍能保持原酶活性,pH3时能耐100℃加热处理45分钟,但在碱性环境中溶菌酶对热稳定性较差.最适pH为6.6,作用的最适温度为45℃～50℃.

猪圆环病毒Cap蛋白的分泌表达及其免疫原性研究

探索利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac expression system)分泌表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白及将其作为亚单位疫苗的应用价值。将PCV2 Cap基因克隆到已插入蜂毒信号肽(Melittin)的转移载体pFastBacⅠ中,将鉴定正确的重组质粒(pFastBAC-Cap)转化至DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经抗性及蓝白斑筛选得到含Cap基因的重组杆状病毒DNA(Bacmid-Cap),转染提取的Bacmid-Cap DNA转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBac-Cap),应用无血清培养的High Five细胞进行重组蛋白的表达及条件优化。重组蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)证明:在重组杆状病毒感染的High Five昆虫细胞中获得分泌表达,并可产生较高浓度的重组蛋白;Western blotting结果显示:重组蛋白可被猪PCV2的特异性抗体所识别,表明重组蛋白具有反应原性;应用重组蛋白免疫BALB/C小鼠试验结果显示:该蛋白可刺激小鼠产生较高水平的特异性抗体。该研究成功分泌表达了PCV2 Cap蛋白,该蛋白能够刺激机体产生免疫应答,为PCV2亚单位疫苗的研制打下基础。

副猪嗜血杆菌ompP2基因的克隆、表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌的外膜蛋白ompP2基因,序列测定结果表明扩增片段全长1 188bp。将扩增片段插入表达载体pET-32a,转化BL21进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果证实重组融合蛋白约为60 000,West-ern-blot结果表明重组表达蛋白具有免疫反应性。以纯化的重组蛋白ompP2作为抗原,建立副猪嗜血杆菌的抗体间接ELISA检测方法。通过试验确定最佳反应条件为抗原包被质量浓度4.75mg/L,4℃包被过夜,待检血清的稀释浓度为1∶40,阳性判断标准为D630大于0.383。特异性和重复性试验表明,建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,可用于副猪嗜血杆菌的检测。

鸭大肠杆菌病的病原特征及防治措施

鸭大肠杆菌病是规模化养鸭场的常见病和多发病,随着集约化、规模化养殖业的发展,该病已成为制约养鸭业发展的主要疾病之一,尤其是在混合感染的情况下会造成严重的经济损失。国内外对本病的研究已经较深入,在血清型的鉴定、免疫学、PCR快速诊断技术及疫苗的研制方面做过大量的报道。本文从该病的病原学、流行病学和诊断等方面作了阐述,并针对该病的预防和控制提出了相应措施。

副猪嗜血杆菌ompP2基因的克隆鉴定及序列分析

用PCR技术对华南地区分离的17株不同血清型副猪嗜血杆菌菌株ompP2基因进行克隆鉴定,并以CLUSTALS1和PHYLIP-3.68软件将ompP2基因序列进行比对和遗传进化分析。17株副猪嗜血杆菌菌株中均能扩出ompP2基因,克隆测序结果发现ompP2基因大小有所不同,与参考序列ABKM01000007的同源性在92%～99%之间。序列比较结果显示,ompP2基因与GenBank公布的副猪嗜血杆菌全基因组测序中的ompP2基因序列具有较高的同源性,不同菌株ompP2基因序列大小存在差异,为进一步验证ompP2蛋白的功能及相关研究奠定了基础。

溶菌酶在饲料中的应用

溶菌酶(Lysozyme)又称胞壁质酶或N-乙酰胞质聚糖水解酶,是动物体内一种非特异性免疫因子,具有抗菌消炎、抗病毒、增强免疫力、促进双歧杆菌等有益菌增殖的作用。本文介绍了溶菌酶的特性、分类和作用机理,重点综述了溶菌酶作为饲料添加剂在猪、鸡、鸭、反刍动物以及水产动物等饲料中的应用研究进展及前景。