表没食子儿茶素没食子酸酯对人Tenon囊成纤维细胞活化的抑制作用及其调控机制

目的探讨绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)活化的作用及其可能的作用机制。方法收集9例9眼晚期原发性开角型青光眼患者小梁切除术中获取的结膜下Tenon囊组织,通过组织贴壁培养获得原代细胞,采用免疫荧光染色法(波形蛋白+角蛋白)进行细胞鉴定,取4~6代细胞进行后续实验。利用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测0~80μmol/L EGCG干预条件下的细胞存活率。将细胞分为空白对照组、转化生长因子(TGF)-β1诱导组和EGCG干预组,分别于正常培养基、含10 ng/ml TGF-β1培养基以及含10 ng/ml TGF-β1+50μmol/L EGCG培养基中培养。采用BrdU标记法检测各组细胞增生率,采用细胞划痕实验观察各组细胞迁移情况,采用免疫荧光法检测各组细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,采用Western blot法检测空白对照组、TGF-β1诱导组、10μmol/L EGCG组和50μmol/L EGCG组Smad2/3、p-Smad2/3、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)及磷酸化Akt(p-Akt)的表达。结果体外培养HTFs呈长梭形,生长规律,免疫荧光鉴定波形蛋白呈阳性。CCK-8检测显示,10、20、30、40、50μmol/L EGCG处理细胞存活率与0μmol/L EGCG处理细胞比较,差异均无统计学意义(均P<0.05)。BrdU标记实验显示,TGF-β1诱导组细胞增生率为(66.37±12.65)%,高于EGCG组的(14.75±12.33)%,差异有统计学意义(P<0.05)。划痕实验第3天,TGF-β1诱导组相对划痕面积为(47.33±12.22)%,明显低于EGCG干预组的(92.67±4.04)%,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示,TGF-β1诱导组细胞α-SMA蛋白荧光较空白对照组显著增强,EGCG干预组α-SMA蛋白荧光则减弱至空白对照组水平。Western blot法检测结果显示,各组间细胞中p-Smad2/3、PI3K和p-Akt蛋白相对表达量总体比较差异均有统计学意义(F=58.820、121.153、69.289,均P<0.001),其中TGF-β1诱导组p-Smad2/3、PI3K和p-Akt蛋白相对表达量明显高于空白对照组、10μmol/L和50μmol/L EGCG组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论EGCG能够通过Smad通路及PI3K/Akt信号通路抑制TGF-β1诱导的HTFs活化。

γ-分泌酶抑制剂对视网膜新生血管形成的抑制作用及Nocth1信号通路调控机制

目的研究Notch1信号通路抑制剂γ-分泌酶抑制剂(DAPT)对氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜新生血管形成的抑制作用及其可能机制。方法将SPF级出生后第7天(P7)的幼鼠与C57BL/6J母鼠共同饲养于含75%氧气的氧箱中5 d,然后放回正常氧气环境下饲养,以制备OIR模型。采用随机数表法将54只OIR小鼠分为OIR组、OIR+DMSO组和OIR+DAPT组,每组18只,所有小鼠右眼作为实验眼。OIR+DAPT组和OIR+DMSO组在P14小鼠玻璃体腔内分别注射10 mmol/L DAPT和DMSO溶液1μl,OIR组不予注射。P17时处死各组小鼠,摘出眼球后分离视网膜,采用Western blot法测定Notch1信号通路蛋白及其下游Hes1蛋白、视网膜小胶质细胞M1型标志物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和M2型标志物精氨酸酶-1(Arg-1)蛋白的相对表达量;制备视网膜铺片,采用同工凝集素(IB4)染色视网膜血管,计算小鼠视网膜新生血管相对面积,定义为新生血管面积/视网膜总面积×100%;采用苏木素-伊红染色法观察突破视网膜内界膜的血管内皮细胞数量。结果OIR+DAPT组、OIR组和OIR+DMSO组小鼠视网膜中Notch1蛋白相对表达量分别为0.68±0.06、1.00±0.00和1.03±0.08,Hes1蛋白相对表达量分别为0.70±0.08、1.00±0.00和1.02±0.07,组间总体比较差异有统计学意义(F=70.62、53.65,均P<0.01)。OIR+DAPT组小鼠视网膜中Notch1和Hes1蛋白相对表达量均明显低于OIR组和OIR+DMSO组,差异均有统计学意义(均P<0.01)。OIR+DAPT组、OIR组和OIR+DMSO组小鼠视网膜中Arg-1蛋白相对表达量分别为1.49±0.12、1.00±0.00和0.94±0.07,iNOS蛋白相对表达量分别为0.74±0.07、1.00±0.00和1.04±0.10,组间总体比较差异均有统计学意义(F=89.32、31.63,均P<0.01),与OIR组和OIR+DMSO组比较,OIR+DAPT组小鼠视网膜中Arg-1蛋白相对表达量明显升高,iNOS蛋白相对表达量明显下降,差异均有统计学意义(均P<0.01)。OIR+DAPT组、OIR组和OIR+DMSO组小鼠视网膜新生血管相对面积分别为(8.82±2.71)%、(22.32±5.34)%和(20.27±3.36)%,突破内界膜的血管内皮细胞数分别为38.17±3.29、60.83±5.11和58.67±4.75,总体比较差异均有统计学意义(F=33.72、39.44,均P<0.01)。与OIR组和OIR+DMSO组比较,OIR+DAPT组小鼠视网膜新生血管相对面积缩小,突破视网膜内界膜的血管内皮细胞数较少,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论玻璃体腔注射DAPT可抑制OIR小鼠视网膜新生血管形成,其作用主要是通过抑制Notch1信号通路活化,进而促使M1型视网膜小胶质细胞向M2型转化来实现。

CKAP2对高糖培养的人视网膜血管内皮细胞的作用研究

目的探讨细胞骨架蛋白2(CKAP2)对高糖培养的人视网膜血管内皮细胞的作用。方法体外培养人视网膜微血管内皮细胞(HRMECs)株,分为正常对照组(CON组)、高渗培养组(30 mmol/L甘露醇,HO组)、高糖培养组(30 mmol/L D-葡萄糖,HG组)。RT-PCR和Western blot法分别检测CKAP2 mRNA及蛋白表达情况。分别用siCKAP2转染HRMECs阻断CKAP2,或加入雷珠单抗(106μg/mL)阻断血管内皮生长因子后,细胞增殖、划痕和小管形成实验检测细胞的增殖率、迁移能力和成管能力。结果①与正常对照组、高渗组相比,高糖组CKAP2的mRNA和蛋白表达上调;②阻断CKAP2后,细胞的增殖能力、迁移能力和血管形成能力明显减弱;③阻断CKAP2与阻断血管内皮生长因子对降低细胞的增殖、迁移和成管能力的作用相似。结论 CKAP2可影响视网膜微血管内皮细胞的增殖、迁移和成管能力,其作用效果可能与血管内皮生长因子相似。

儿童葡萄膜炎患者黄斑区微血管结构变化

目的观察并分析单侧儿童葡萄膜炎(PU)患眼及对侧健康眼黄斑区微血管结构变化。方法横断面病例对照研究。2019年1月至2021年7月于北京协和医院眼科检查确诊的单侧炎症安静期PU患者21例21只眼(PU组)纳入研究。将PU患者未受累对侧眼作为对侧眼组;选取同期年龄匹配的健康志愿者21名21只眼作为正常对照组(NC组)。采用光相干断层扫描血管成像仪对受检眼黄斑区6 mm×6 mm范围进行扫描,测量视网膜浅层毛细血管丛(SCP)、深层毛细血管丛(DCP)血管密度以及黄斑中心凹无血管区(FAZ)面积、中心凹下脉络膜厚度(SFCT)、中心凹视网膜厚度(CRT)。采用设备自带软件测量以黄斑中心凹为中心,直径分别为1.0、1.5、3.0 mm环形区域的脉络膜毛细血管密度(CCD),分别记录为CCD-1.0、CCD-1.5、CCD-3.0。三组间计量资料比较采用方差分析;若三组数据方差不齐则采用Kruskal-Wallis检验。多元线性回归分析评估CCD的潜在相关因素。结果与对侧眼组、NC组比较,PU组SCP(H=-13.857、-25.500,P=0.043、P<0.001)、DCP(H=-15.333、-31.595、P=0.007、P<0.001)血管密度和CCD-1.0(H=-14.000、-16.214,P=0.040、0.012)均显著降低,差异有统计学意义。PU组、NC组CRT、FAZ面积比较,差异无统计学意义(F=0.955,P=1.000、0.661)。与NC组比较,对侧眼组SCP、DCP血管密度均降低,其中DCP血管密度的差异有统计学意义(H=-16.262,P=0.004);两组受检眼CCD比较,差异无统计学意义(P=1.000)。与NC组比较,PU组SFCT更厚,差异有统计学意义(F=5.552,P=0.004);与对侧眼组比较,差异无统计学意义(F=5.552,P=0.270)。多元线性回归分析结果显示,CCD-1.0、CCD-1.5、CCD-3.0与FAZ面积(β=-0.494、-0.527、-0.566,P=0.015、0.009、0.010)、CRT(β=-0.322、-0.466、-0.342,P=0.026、0.002、0.028)呈线性相关;CCD-1.0、CCD-1.5与DCP血管密度(β=0.277、0.275,P=0.047、0.045)呈线性相关。结论安静期PU患眼的视网膜和脉络膜微血管结构均存在异常;未受累对侧眼可能存在黄斑循环障碍。