人肺癌组织总RNA转染树突状细胞方法的优化

背景与目的树突状细胞(dendriticcell,DCs)作为体内惟一能活化初始T细胞的抗原递呈细胞,是激发机体特异性免疫反应的关键,以DCs为基础构建的疫苗广泛应用于各种肿瘤免疫治疗中。其中RNA转染DCs构建DCs疫苗的方法,因避免了抗原的筛选和鉴定,所需肿瘤量小等优点,特别适于像肺癌这样的缺乏特异性肿瘤抗原、异质性大、抗原性弱的肿瘤。然而,目前缺乏RNA转染DCs的最佳时间和方法的研究。本研究以人肺癌组织总RNA体外转染DCs,试图摸索转染DCs的最佳条件。方法用免疫组化的方法选择肿瘤组织癌胚抗原CEA、粘蛋白MUC1双阳性的10例肺癌患者,一步法提取肿瘤组织总RNA,采集和分离外周血单核细胞,体外培养DCs和T细胞,将RNA于不同时间和不同方法转染DCs,用流式细胞仪检测CEA和MUC1的表达,混合淋巴细胞反应测定DCs刺激自体T细胞增殖能力。结果未成熟期DCs转染人肺癌总RNA后CEA和MUC1表达量(11.33±2.64和39.68±7.25)明显高于成熟期DCs(5.46±1.63和27.17±4.16),且刺激自身T细胞增殖反应能力更强。电穿孔法转染人肺癌总RNA后DCs表达CEA和MUC1的量(20.53±3.64和65.39±9.33)明显多于脂质体转染(11.33±2.64和39.68±7.25)和直接混合法(0.91±0.27和18.53±3.26),且刺激自身T细胞增殖反应能力更强。结论采用电穿孔法将肺癌总RNA体外转染未成熟DCs可以使DCs表达肿瘤抗原量更高,刺激T细胞增殖的活性更强。

RNA干扰MAGEA3对人肝癌细胞凋亡的影响

目的:探讨小发夹RNA(shRNA)载体介导抑制人肝癌细胞中黑色素瘤相关抗原A3(MAGEA3)的表达和对肝癌细胞凋亡的影响。方法:构建pS ilencer-MAGEA3短发夹状siRNA真核基因表达载体,采用脂质体介导的方法将其转染到人肝癌细胞(m el-ed1)中,用W estern印迹法、RT-PCR检测MAGEA3基因在肝癌细胞中的表达;通过原位末端标记TUNEL法、DNA片段化及Annexin V/PI双标记法检测,观察其对肝癌细胞凋亡的影响。结果:成功构建pS ilencer-MAGEA3短发夹状siRNA真核基因表达载体,转染特异性小发夹RNA质粒表达载体的MEL-ED1细胞中MAGEA3基因表达显著抑制(90%)。与对照组比较,pS ilencer-MAGEA3转染组肝癌细胞培养48 h后,DNA片段化检测出“DNA ladder”、TUNEL法显示细胞典型凋亡特征,Annexin V/PI双标检测转染组细胞凋亡率为21.41%±1.98%,明显高于pS ilencer-neo空载体转染组和未转染组(P<0.01)。结论:MAGEA3小发夹RNA质粒载体可显著抑制MEL-ED1细胞中的MAGEA3基因的表达,促进肝癌细胞的凋亡,MAGEA3基因具有抑制凋亡的作用。该研究为应用RNA i进行肿瘤的基因治疗提供了实验依据。